一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，包括下列步骤：1)将deer‑IGF‑Ⅰ基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒；2)对所述重组质粒进行扩增，并从中筛选出阳性的重组质粒；3)用SalⅠ酶对阳性的重组质粒进行酶切线性化，并将酶切线性化后的阳性的重组质粒电转化入巴斯德毕赤酵母GS115，得到阳性重组子；4)在BMGY培养基中通过甲醇对所述阳性重组子进行诱导表达，使所述阳性重组子诱导表达可溶于BMGY培养基的deer‑IGF‑Ⅰ蛋白；5)从BMGY培养基分离出deer‑IGF‑Ⅰ蛋白。其技术效果是：纯化方法简便，无需进行蛋白的变性复性，蛋白的结构更稳定，经济效益更高，便于大规模制备，应用前景广。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，包括下列步骤：1)将deer?IGF?Ⅰ基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒；2)对所述重组质粒进行扩增，并从中筛选出阳性的重组质粒；3)用SalⅠ酶对阳性的重组质粒进行酶切线性化，并将酶切线性化后的阳性的重组质粒电转化入巴斯德毕赤酵母GS115，得到阳性重组子；4)在BMGY培养基中通过甲醇对所述阳性重组子进行诱导表达，使所述阳性重组子诱导表达可溶于BMGY培养基的deer?IGF?Ⅰ蛋白；5)从BMGY培养基分离出deer?IGF?Ⅰ蛋白。其技术效果是：纯化方法简便，无需进行蛋白的变性复性，蛋白的结构更稳定，经济效益更高，便于大规模制备，应用前景广。【专利说明】
本专利技术涉及生物工程领域的。
技术介绍
IGF(insulin_like growth factors)，中文翻译为胰岛素样生长因子或类胰岛素 生长因子，因其结构与胰岛素类似而得名；也被称为〃生长激素介质〃（即SM， somatomedins)。是生长激素产生生理作用过程中必需的一种活性蛋白多肽物质。现在已知 的胰岛素样生长有IGF-I和IGF-II两种。生长激素的生理作用包括促进生长，且对于糖、脂、 蛋白质代谢和无机盐代谢必不可少。 已知的IGF-I是一种活性蛋白多肽物质，它是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十 几种细胞自分泌和旁分泌的产物，也就是说人体内本身就含有IGF-I。其具体功能如下： 降血糖:在这方面IGF-I与胰岛素相似，能增强人体对葡萄糖和氨基酸的吸收，促 进糖原的合成和乳酸分泌，抑制糖原分解，增加人体对胰岛素灵敏度的功能，提高人体胰岛 素的作用效率。对胰岛素非依赖型糖尿病，即II型糖尿病具有较好的疗效。 降血脂：IGF_I作用于脂肪细胞能促进脂肪分解和糖原合成，降低血中总甘油三 酯、降低密度脂蛋白甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的水平。 舒张血管：IGF-I能调节心脏的生理和病理状况，具有舒张血管，降低血管阻力，增 加心脏的血流量的作用。 促进骨的合成代谢保持其正常结构功能：IGF_I可明显地促进多种来源的软骨细 胞分裂增殖和软骨基质的合成。IGF-I还可刺激软骨细胞合成软骨基质特异型胶原蛋白-II 型胶原，增加糖胺聚酶的活性，增强成骨细胞的碱性磷酸酯酶的活性。 促生长:IGF-I是人体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂。 促细胞分化：IGF-I对维持与细胞分化有关蛋白质水平十分重要，与一些生长因子 合用能促进细胞分化成熟。创伤修复：IGF-I还参与创伤愈合的过程。实验证明，损伤的神经、肌肉和肉皮细胞 中IGF-I浓度增加。由于马鹿的鹿茸中含有大量的活性多肽，具有广泛的药用价值，多肽中最具价值 的是马鹿胰岛素生长因子，即deer-IGF-I，但是鹿茸每年只能收集一次，并且deer-IGF-I在 鹿茸中的含量比较低，因此需要一种马鹿胰岛素样生长因子表达纯化工艺，简化鹿胰岛素 生长因子的纯化工艺，降低成本，以克服鹿茸收集次数少，其中deer-IGF-I的含量技术问 题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种梅花鹿IGF-I蛋白真核表达 方法，其纯化方法简便，无需进行蛋白的变性复性，蛋白经过磷酸化，糖基化修饰可使蛋白 活性更强，蛋白的结构更稳定，经济效益更高；分离方法简便，便于大规模制备，应用前景 广。 实现上述目的的的一种技术方案是：一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方 法，包括下列步骤： 1)将deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒； 2)对所述重组质粒进行扩增，并从中筛选出阳性的重组质粒； 3)用Sal頂每对阳性的重组质粒进行酶切线性化，并将酶切线性化后的阳性的重 组质粒电转化入巴斯德毕赤酵母GS115,得到阳性重组子； 4)在BMGY培养基中通过甲醇对所述阳性重组子进行诱导表达，使所述阳性重组子 诱导表达可溶于BMGY培养基的deer-IGF-I蛋白； 5)从BMGY培养基分离出deer-IGF-I蛋白。 进一步的，步骤1包括下列步骤： la.通过PCR引物在deer-IGF-I基因片段的上游引入EcoR I酶切位点和HIS标签蛋 白，下游引入Not頂每切位点和终止密码子； lb.在pPIC9k质粒上进行EcoR頂每切位点和Not頂每切位点上的双酶切； lc.将deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒。再进一步的，步骤1中， EcoR I酶切位点引入的PCR引物为F:CCGG AATT CATG CATC ATCA CCAT CACC ATGG AAAA ATCA GCAG TCTT CC, Not I酶切位点引入的PCR引物为R:ATAA GAAT CTAC ATTC TGTA GTTC TTGT TTCC〇 再进一步的，步骤2包括下列步骤： 2a.将所述重组质粒转入体系转化DH5a感受态大肠杆菌，得到转化子； 2b.对所述转化子进行扩增； 2c.用氨苄抗性平板筛选扩增后的转化子，从中选取阳性的转化子，再从阳性的转 化子中提取阳性的重组质粒。再进一步的，步骤3中利用HIS缺陷平板筛，筛选阳性重组子。再进一步的，步骤4中的BMGY培养基分为培养用BMGY培养基和诱导表达用BMGY培 养基，步骤4分为下列步骤： 4a.在培养用BMGY培养基中培养所述阳性重组子直至培养用BMGY培养基的0D600 值达到8~10;所述培养用BMGY培养基的温度为27~30°C，振动速率为250rpm; 4b.将培养用BMGY培养基中的阳性重组子接种到诱导表达用BMGY培养基中，所述 诱导表达用BMGY培养基中的阳性重组子的接种量为每毫升10D，再分次将甲醇加入所述诱 导表达用BMGY培养基中，对所述阳性重组子进行deer-IGF-I蛋白的诱导表达。更进一步的，步骤4b中，在48小时内，分次将甲醇加入所述诱导表达用BMGY培养基 中，对所述阳性重组子进行deer-IGF-I蛋白的诱导表达，补加甲醇的频率为12小时一次，每 次补加甲醇后，所述诱导表达用BMGY培养基中的甲醇的浓度为0.5vol. %。 进一步的，步骤5包括下列步骤： 5a.对所述诱导表达用BMGY培养基进行离心分离，收集上层清液； 5b.对所述上层清进行超滤浓缩； 5c.再使经过浓缩的上层清液通过镍离子柱，以进行deer-IGF-I蛋白的纯化和杂 蛋白的去除，收集含有deer-IGF-I蛋白的洗脱液； 5d.对所述洗脱液进行透析除盐； 5e.对透析除盐后的洗脱液进行低温超滤浓缩，得到deer-IGF-I蛋白。 进一步的，通过MTT法，用MCF-7细胞检测deer-IGF-I蛋白的活性。本专利技术的一种梅花鹿IGF-I蛋白真核表达方法的技术方案，包括下列步骤：1)将 deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒;2)对所述重组质粒进行扩增，并从 中筛选出阳性的重组质粒;3)用Sal I酶对阳性的重组质粒进行酶切线性化，并将酶切线性 化后的阳性的重组质粒电转化入巴斯德毕赤酵母GS115,得到阳性重组子;4)在BMGY培养基 中通过甲醇对所述阳性重组子进行诱导表达，使所述阳性重组子诱导表达可溶于BMGY培养 基的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，包括下列步骤：1)将deer‑IGF‑I基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒；2)对所述重组质粒进行扩增，并从中筛选出阳性的重组质粒；3)用Sal I酶对阳性的重组质粒进行酶切线性化，并将酶切线性化后的阳性的重组质粒电转化入巴斯德毕赤酵母GS115，得到阳性重组子；4)在BMGY培养基中通过甲醇对所述阳性重组子进行诱导表达，使所述阳性重组子诱导表达可溶于BMGY培养基的deer‑IGF‑I蛋白；5)从BMGY培养基分离出deer‑IGF‑I蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建兵，王瑜，党平，
申请(专利权)人：上海蓝庄生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31