本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测白血病融合基因的引物和探针组合、含有该引物和探针组合的试剂盒以及采用该引物和探针组合或试剂盒进行白血病融合基因检测的多重荧光RT‑PCR方法。本发明专利技术基于多重荧光RT‑PCR技术，简单、快捷，灵敏度高。此外，本发明专利技术通过合理的引物和探针搭配，有效避免了引物与引物之间、引物与探针之间以及探针与探针之间的相互作用，减少了检测误差。采用本发明专利技术的检测方法可以全面地对45种白血病融合基因进行定性检测，有效缩短了检测时间，为临床白血病的诊断、疗效评价以及预后提供了非常重要的检测手段。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于基因工程
，公开了一种用于检测白血病融合基因的引物和探针组合、含有该引物和探针组合的试剂盒以及采用该引物和探针组合或试剂盒进行白血病融合基因检测的多重荧光RT?PCR方法。本专利技术基于多重荧光RT?PCR技术，简单、快捷，灵敏度高。此外，本专利技术通过合理的引物和探针搭配，有效避免了引物与引物之间、引物与探针之间以及探针与探针之间的相互作用，减少了检测误差。采用本专利技术的检测方法可以全面地对45种白血病融合基因进行定性检测，有效缩短了检测时间，为临床白血病的诊断、疗效评价以及预后提供了非常重要的检测手段。【专利说明】
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及用于定性检测白血病融合基因的引物、 探针、试剂盒及方法。
技术介绍
白血病是儿童和青年中最常见的一种恶性克隆性疾病。多项研究表明大部分的白 血病患者中存在某种染色体结构的畸变(缺失、重复、倒位、易位等），这些是导致白血病发 生以及发展的重要原因。染色体结构的畸变，会导致原癌基因及抑癌基因的结构变异，使得 癌基因、原癌基因突变激活，抑癌基因缺失或失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。因而 不同的融合基因已经成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志。如慢性髓细胞白血病 (CML)中的BCR-ABL1融合基因，急性早幼粒细胞白血病(APL)中的PML-RARA融合基因已成为 各自的分子标志并进一步成为治疗的靶标。2000年WHO关于白血病分型的标准中更是将其 中一些常见的异常归纳为白血病基本诊断的标准之一。鉴于白血病相关融合基因的检测对 于白血病诊断、分型、临床治疗选择、预后疗效评价以及微小残留病(MRD)检测上的临床价 值，融合基因检测技术的开发具有极大的临床意义和市场价值。 目前，融合基因的检测方法主要包括染色体核型分析、荧光原位杂交技术以及聚 合酶链式反应(PCR)。与染色体核型分析和荧光原位杂交技术相比，PCR检测方法具有快速 有效、灵敏度高等优点，在临床上有较广的应用。多重PCR技术是指在同一个PCR体系中加入 多对引物，能够同时扩增出多个DNA片段。作为PCR重要的衍生技术，多重PCR可以同时扩增 多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，尤其是能够提高检测的灵敏度。 荧光RT-PCR是在逆转录之后进行实时荧光PCR检测，其主要优势在于用实时荧光PCR平台代 替普通的PCR以及电泳分析。实时荧光PCR具有如下优点：（1)闭管操作、封闭状态检测，减少 了模板污染和假阳性的可能；（2)无需对PCR产物进行后处理，操作更简便快速；（3)灵敏度 高，可以检测单拷贝基因；（4)特异性高，可通过探针与靶序列特异性的结合，特异性地检测 目的基因；（5)通过标准曲线和Ct值进行定量分析。2003年25个欧洲实验室通过EAC项目 (Europe Against Cancer Program)合作，对白血病中常见的10个融合基因的检测建立了 标准化的实时荧光RT-PCR方法，包括荧光PCR引物以及探针（Leukemia，2003,17,2318- 2357)。之后许多针对白血病融合基因的荧光检测方法都是在此项研究的基础上发展起来 的。 然而，多重荧光RT-PCR技术需要在同一个PCR反应体系中加入多对引物，甚至是多 条探针，这样就增加了多对引物以及多条探针在反应体系中相互作用以及形成二聚体的几 率，从而降低了PCR反应的特异性和效率，甚至不能扩增出特异性目标产物。此外，随着人们 对白血病研究的不断深入，越来越多的白血病融合基因已被发现，当前检测白血病融合基 因的方法已经远远不能满足人们对于同时检测绝大部分融合基因的需求，亟需一种快速、 有效且易于标准化的能同时定性检测绝大部分白血病融合基因的方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的白血病融合基因数据库，重 新设计了用于检测白血病融合基因的检测引物和探针以及多重荧光RT-PCR方法。本专利技术的 检测方法快速、有效且易于对45种白血病融合基因进行标准化的高灵敏度定性检测。 为此，本专利技术一方面提供了一种用于检测白血病融合基因的引物和探针组合，其 由SEQ ID N0.1-114所示的引物和探针组成。 在本专利技术优选的实施方案中，该引物和探针组合进一步由第1-12组引物和探针组 成，其中第1组由SEQ ID N0.1-9所示的引物和SEQ ID N0.10-11所示的探针组成，第2组由 SEQ ID N0.12-16所示的引物和SEQ ID N0.17-18所示的探针组成，第3组由SEQ ID NO. 19- 27所示的引物和SEQ ID NO.28-29所示的探针组成，第4组由SEQ ID NO.30-35所示的引物 和SEQ ID NO. 36-38所示的探针组成，第5组由SEQ ID NO. 39-43所示的引物和SEQ ID NO.44-45所示的探针组成，第6组由SEQ ID NO.46-50所示的引物和SEQ ID NO.51-52所示 的探针组成，第7组由SEQ ID NO.53-59所示的引物和SEQ ID NO.60-62所示的探针组成，第 8组由SEQ ID N0.63-66所示的引物和SEQ ID N0.67-88所示的探针组成，第9组由SEQ ID NO.69-76所示的引物和SEQ ID NO.77-78所示的探针组成，第10组由SEQ ID NO.79-87所示 的引物和SEQ ID NO.88-89所示的探针组成，第11组由SEQ ID NO.90-99所示的引物和SEQ ID NO. 100-101所示的探针组成，第12组由SEQ ID NO. 102-111所示的引物和SEQ ID NO. 112-114所示的探针组成。 本专利技术通过选择相关基因断裂位点上游序列和下游序列，来进行特异性多重荧光 RT-PCR引物和探针的设计。所设计的引物Tm值均在60°C附近，整合搭配各个引物，从而尽量 避免了引物二聚体的产生;探针Tm值均在70°C附近，避免了探针与其他非特异性序列之间 的结合，同时也避免了探针相互之间形成复杂的二聚体，提高了 PCR扩增的特异性和效率。 针对45种白血病融合基因，本专利技术设计的具体引物和探针情况如表1所示。 表1、本专利技术的引物和探针情况表 在本专利技术优选的实施方案中，部分探针的5'端连接荧光报告基团FAM，3'端连接荧 光淬灭基团TAMRA;其余探针的5 '端连接荧光报告基团J0E，3 '端连接荧光淬灭基团TAMRA; 内参基因 GAPDH探针的5'端连接荧光报告基团J0E，3'端连接荧光淬灭基团TAMRA。 本专利技术另一方面提供了一种用于检测白血病融合基因的试剂盒，其包含本专利技术所 述的引物和探针组合。 在本专利技术优选的实施方案中，试剂盒中全部引物的浓度为3pm〇lAU，全部探针的 浓度为 2ρηιο1/μ1。 本专利技术另一方面提供了本专利技术所述的引物和探针组合在制备检测白血病融合基 因试剂盒中的应用。 本专利技术再一方面提供了本专利技术所述的引物和探针组合，或者本专利技术所述的试剂盒 在检测白血病融合基因中的应用。 本专利技术最后一方面提供了一种检测白血病融合基因的多重荧光RT-PCR方法，其包 含以下步骤： 1、获取待测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测白血病融合基因的引物和探针组合，其由SEQ ID NO.1‑114所示的引物和探针组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑仲征，杜金伟，张鹏，王莉萍，潘捷，杜可明，
申请(专利权)人：上海荻硕贝肯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。