本发明专利技术公开了一种褐飞虱基因NlABCB及其编码产物与应用，该基因NlABCB具有SEQIDNo.1的DNA序列。该序列由1468个核苷酸碱基组成，包含一个由459个核苷酸构成的完整的编码框，编码153个氨基酸残基的小分子量蛋白。研究发现该基因与褐飞虱的消化取食、存活有关。构建L4440‑NlABCB的dsRNA载体，转化E.coli HT115后，经IPTG诱导，形成NlABCB‑dsRNA,喂养褐飞虱取食含NlABCB‑dsRNA人工饲料，发现褐飞虱的存活率明显降低。本发明专利技术将在作物育种，生物农药和转基因动物培养中得到广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别地，涉及一种褐飞虱基因NlABCB及其编码产物与应用。
技术介绍
水稻(Oryza sativa)是世界的主要粮食作物之一，全球超过一半人口都以水稻作为主食。专家估计到了2025年，世界水稻的产量要比现在增长60％才能够满足需要。我国是水稻生产大国，水稻常年种植面积约3000万公顷，占世界水稻种植总面积的1/4。因此，水稻的种植安全与与我国经济发展和人民生活密不可分。褐飞虱(Nilaparvata lugensBPH)属同翅目飞虱科(Homoptera:Delphacidae)昆虫，又称褐稻虱。褐飞虱主要通过吸取水稻韧皮部的汁液，最先受到伤害是水稻的叶鞘组织，同时会引起叶片枯黄，分蘖枯萎，所以营养物质的运输受到阻断，同时导致水稻受到一系列的生理方面的影响，包括植株的发育，水稻的产量等。被害稻田常先在田中间出现“黄塘”，后出现“冒穿”或“虱烧”，严重时造成大幅度减产甚至颗粒无收。褐飞虱取食、产卵，造成大量伤口，有利于病菌侵入，会加重纹枯病和小球菌核病发生和危害。水稻的伤口大时，稻株因体内汁液大量丧失而枯黄，飞虱在叶片或穗子上排出大量蜜露，还会影响水稻光合作用，滋生霉菌，引起稻粒霉烂。当大量褐飞虱取食水稻时，水稻的生长发育受到巨大影响，导致植株矮小；到了后期就会形成半枯穗，导致整个植株枯萎倾倒。同时褐飞虱在取食韧皮部的同时，会作为传播纹枯病和矮杆病毒的载体，如果此时晚稻处在孕穗到蜡熟的阶段，那么由于褐飞虱危害所造成的损失将会十分惨重。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源或内源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象。高浓度的dsRNA才能保证靶标基因的连续抑制，那么利用体外合成的dsRNA来喂养昆虫成本相对昂贵。HT115菌株是RNaseIII缺失体，RNaseIII能降解细菌中绝大多数的dsRNA，那么利用基因工程菌大肠杆菌HT115表达dsRNA是一个非常经济的方法产生大量的dsRNA。除此而外，细菌喂养也是一种非中断技术保持处理动物的一致性。Timmons等是最早利用HT115生产的dsRNA喂食线虫使其体内的靶标基因抑制表达。利用大肠杆菌表达dsRNA已在昆虫桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中得以实现。因此，至今为止，国内外尚没有克隆到褐飞虱的相关靶标基因，可以通过人工喂养dsRNA沉默该基因而达到控制褐飞虱的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种褐飞虱基因NlABCB及其编码产物与应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐飞虱基因NlABCB，它具有SEQ ID No.1的DNA序列。一种所述基因NlABCB的编码蛋白，它包含SEQ ID No.2的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQ ID No.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。一种所述褐飞虱基因NlABCB在人工喂养中的应用。一种所述褐飞虱基因NlABCB在作物育种中的应用。一种所述褐飞虱基因NlABCB在转基因动物培养中的应用。一种所述褐飞虱基因NlABCB在生物农药中的应用。本专利技术的有益效果是，通过对褐飞虱中肠转录组分析，并结合褐飞虱基因组数据库获得了NlABCB基因全长；构建L4440-NlABCB的dsRNA载体，转化E.coli HT115后，经IPTG诱导，形成NlABCB-dsRNA，喂养褐飞虱取食含NlABCB-dsRNA的人工饲料，分析NlABCB基因在RNAi沉默后，褐飞虱中NlABCB mRNA的表达水平及相应死亡率。该基因的分离克隆，对于作物的抗虫育种，转基因褐飞虱动物培养，尤其对水稻的生物防治如生物农药的生产中将起到重要的促进作用。附图说明图1是RACE获得的褐飞虱NlABCB基因电泳图，图中M为DL2000 DNA Marker，1-2泳道为NlABCB基因的5’cDNA片段和3’cDNA片段。图2是L4440载体图。图3是L4440-NlABCB-dsRNA的电泳图，图中M为MarkerIII，1-2泳道为L4440和L4440-NlABCB-dsRNA。图4是是褐飞虱取食NlABCB-dsRNA后对其mRNA表达水平的抑制作用柱状图。图5是褐飞虱取食NlABCB-dsRNA后对其存活率的影响图。具体实施方式本专利技术通过构建褐飞虱中肠转录组文库进行高通量测序的方法获得转录组数据，在此基础上获得NlABCB基因片段，以该基因序列为模板设计RACE引物。以提取的总RNA为模板,使用RACE试剂盒分别合成5'和3'RACE cDNA。获得NlABCB CDS全长序列并连接到pMD19-T克隆载体，转化入大肠杆菌感受态细胞(Top10)，摇菌，测序。随后在NlABCB CDS序列中选取450bp长度的片段设计合成L4440-NlABCB，转化E.coli HT115后，经IPTG诱导，形成NlABCB-dsRNA，喂养褐飞虱取食含NlABCB-dsRNA的人工饲料，并用人工喂养对目的基因进行RNAi，检测其对目的基因mRNA表达水平抑制效果及对褐飞虱死亡率的影响。对该基因的分离和克隆以及生物学功能的分析，对于转基因褐飞虱动物培养，水稻抗褐飞虱育种，以及对采用生物农药抗虫起到重要的促进作用。实现本专利技术的具体技术步骤如下：1、NlABCB基因的分离和序列分析利用对褐飞虱中肠转录组测序的方法，获得表达基因数据库，并筛选到NlABCB基因。测序分析发现此转录组序列并没有覆盖该基因的完整编码区。为了获得该片段的完整编码区序列，我们比对褐飞虱基因组数据库初步得到NlABCB基因序列。以提取的总RNA为模板,使用RACE试剂盒分别合成5'和3'RACE cDNA。获得NlABCB CDS全长序列并连接到pMD19-T克隆载体，转化入大肠杆菌感受态细胞(Top10)，摇菌，挑取4个克隆送北京擎科公司测序，每个分别测2次。测序结果，用NCBI Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列比对分析。获得NlABCB基因DNA序列，见序列表SEQID No.1表示的序列和褐飞虱NlABCB基因电泳图1。根据该序列的开放阅读框(ORF)，推算出该基因编码蛋白的氨基酸序列,如SEQID No.2所示。该序列由1468个核苷酸碱基组成，包含一个由459个核苷酸构成的完整的编码框，编码153个氨基酸残基的小分子量蛋白。2、褐飞虱L4440-NlABCB-dsRNA的表达及其RNAi效果以褐飞虱cDNA为模板，扩增褐飞虱NlABCB基因片段。由于L4440载体(图2)包含两个相向排列的T7启动子，经IPTG诱导，分别转录出(+)和(-)ssRNA，然后形成dsRNA。NlABCB基因双酶切连入L4440载体后，转入菌株HT115后，便可表达dsRNA(图3)。分别让褐飞虱取食NlABCB-dsRNA进行RNAi。首先检测褐飞虱取食dsRNA后，对其体内Nl本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种褐飞虱基因NlABCB ，其特征在于，它具有SEQ ID No.1 的DNA 序列。
【技术特征摘要】
1.一种褐飞虱基因NlABCB ，其特征在于，它具有SEQ ID No.1 的DNA 序列。2.一种权利要求1 所述褐飞虱基因NlABCB的编码蛋白，其特征在于，它包含SEQ ID No.2 的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No.2 的氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQ ID No.2...
【专利技术属性】
技术研发人员：游艾青，闸雯俊，周雷，李三和，杨国才，陈志军，刘凯，刘凯，徐华山，李培德，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院粮食作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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