本发明专利技术公开了一种紫花苜蓿抗寒基因MsZFP及其编码蛋白与应用，属于植物基因工程技术领域。该抗寒基因MsZFP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；由紫花苜蓿抗寒基因MsZFP编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。它包含762bp的开放读码框，编码253个氨基酸，预测的分子量约为27.8kDa。本发明专利技术将所述基因导入到烟草中，通过对获得的转基因烟草的研究表明该基因能增强植物抗寒性。该发明专利技术为研究苜蓿抗寒分子机理提供理论依据具有广泛的应用前景。有利于发掘出紫花苜蓿抗寒相关基因，利用基因工程手段创建抗寒苜蓿新种质，改良现有品种的抗寒性。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，属于植物基因工程
该抗寒基因MsZFP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；由紫花苜蓿抗寒基因MsZFP编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。它包含762bp的开放读码框，编码253个氨基酸，预测的分子量约为27.8kDa。本专利技术将所述基因导入到烟草中，通过对获得的转基因烟草的研究表明该基因能增强植物抗寒性。该专利技术为研究苜蓿抗寒分子机理提供理论依据具有广泛的应用前景。有利于发掘出紫花苜蓿抗寒相关基因，利用基因工程手段创建抗寒苜蓿新种质，改良现有品种的抗寒性。【专利说明】一种紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP及其编码蛋白与应用
本专利技术属于植物基因工程
，涉及紫花苜蓿基因 MsZFP的克隆及其在增强 植物抗寒性中的应用，具体涉及一种紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP及其编码蛋白与应用。
技术介绍
植物的正常生长和代谢会受到很多生物和非生物胁迫的影响。凡对植物生长与生 存不利的环境因子，统称为逆境。其中，非生物胁迫中的干旱、盐害和冷害是影响植物生长 发育的主要三大非生物逆境因子，已成为制约农业生产发展的一个全球性问题。据统计，和 正常生长作物相比，这三大非生物胁迫因子每年使全球作物减产至少在50%以上。在我国 寒冷对作物生长影响尤为严重，已制约着某些地区农业生产和农业经济发展。因此，改良和 培育适应不同环境地区生长的植物新品种具有重要意义。 紫花苜蓿是世界上栽培最早，也是最为重要的一种多年生优质豆科牧草。在我国 紫花苜蓿由于北方寒冷漫长的冬季，普遍存在越冬率低的现象，容易发生冻害和死亡，从而 造成大面积减产。低温已成为限制我国北方苜蓿产业发展的主要因素之一，因此研究苜蓿 的抗寒性具有重要的理论和实际意义。 近年来在植物抗寒性研究机理及紫花苜蓿抗寒基因工程方面的研究取得了显著 的进展。研究发现，植物对各种不利环境因子具有一定的抵抗能力，并不是被动的接受逆 境，植物具有一定的抗逆性。在植物长期的进化过程中，植物和低等生物适应逆境的一个重 要策略是即时大量表达多种逆境诱导蛋白，如转录因子、蛋白激酶、解毒酶、水分通道蛋白、 胚胎发育晚期丰富蛋白和渗透调节物质合成酶等。这些蛋白的表达及产物的相互作用提高 了植物对逆境的适应能力。 锌指蛋白是一类转录因子具有手指状的结构域，在细胞分化、基因表达调控、胚胎 发育、增强植物抗逆性等方面具有重要作用。根据其保守结构域的不同，可将锌指蛋白主要 分为C2H2型、C4型和C6型。其中C2H2型占大多数，逆境胁迫会诱导植物中许多C2H2型锌指蛋 白的表达，这些锌指蛋白可以直接参与上游抗逆信号的传导，也可以通过特异性识别激活 植物基因组中许多抗逆基因的表达，从而提高植物抗逆性，说明锌指蛋白可以作为提高植 物抗寒性的候选基因。然而目前的研究中，还没有关于紫花苜蓿ZFP基因在抗寒等生理功能 方面的报道。因此，对紫花苜蓿ZFP的克隆和功能研究可进一步揭示苜蓿抗寒机制，对苜蓿 品种改良具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP及其编码蛋白与应用。 本专利技术是通过以下技术方案来实现： 本专利技术公开了一种紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP，通过PCR方法从紫花苜蓿中克隆得到 ZFP基因全长cDNA，该抗寒基因 MsZFP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。 该抗寒基因 MsZFP是与低温相关的C2H2型锌指蛋白基因，基因全长762bp，编码253 个氨基酸残基，分子量为27.8kDa。本专利技术还公开了上述的紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序 列如SEQ.ID.N0.2所示。本专利技术还公开了含有上述的紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP的表达载体，该表达载体为 PCBM-35S-ZFP，所述表达载体中含有草丁膦筛选标记基因 PPT和组成型启动子35S。 本专利技术公开了上述紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP在提高紫花苜蓿对环境抗寒性能中的 应用。 具体为：构建上述紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP的植物表达载体，再将所构建的植物表 达载体通过农杆菌介导法转化到烟草组织中，筛选获得抗寒性增强的植株。具体步骤为：1) 将苜蓿MsZFP基因核苷酸序列置于CaMV35S启动子之后，构建植物表达载体;2)将表达载体 转入大肠杆菌Top 10感受态细胞;3)利用2)获得的转化子转化烟草，并获得转基因植株。 本专利技术还公开了上述蛋白在提高紫花苜蓿对环境抗寒性能中的应用。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果： 本专利技术公开的紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP及其编码蛋白与应用，通过PCR方法从紫花 苜蓿中克隆得到ZFP基因全长cDNA，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，其编 码的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本专利技术首次公开的紫花苜蓿锌指蛋白基因 MsZFP，是与低温相关的C2H2型锌指蛋白基因，本专利技术运用基因工程技术证实了紫花苜蓿抗 寒基因 MsZFP可以有效改善植物的抗寒性，在提高植物抗寒性和牧草品质改良方面具有重 要的应用价值。 本专利技术的紫花苜蓿MsZFP能够应用于植物抗寒，将含有本专利技术MsZFP基因的植物表 达载体PCBM-35S-ZFP导入到烟草中，培育筛选得到过表达转基因植物，对获得的转基因植 株进行表型分析，结果显示，与野生型相比，转基因植株具有更强的抗寒性。综上所述，本发 明获得的MsZFP是一种锌指蛋白，在提高植物抗寒性和牧草品质改良方面具有重要的应用 价值。【附图说明】 图1为MsZFP的蛋白结构域； 图2为MsZFP与其它物种蛋白质聚类树； 图3为植物表达载体PCBM-35S-ZFP构建示意图；图4为转MsZFP基因抗性苗的PCR鉴定；图5为MsZFP转基因烟草与野生型烟草在低温迫处理下的表型实验结果；图6为低温胁迫条件下转MsZFP基因植株与野生型的电导率； 图7为qRT-PCR分析阳性株系的MsZFP表达量结果。【具体实施方式】 下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而 不是限定。 本专利技术实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。本专利技术实施例 中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 1、一种紫花苜蓿锌指蛋白转录因子基因 MsZFP全长cDNA克隆 本研究克隆的锌指蛋白MsZFP也属于C2H2型，是两个单C2H2型的锌指蛋白，且具有 典型植物特异基序"QALGGH"。保存并搜索从NCBI(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/)数据库中搜索的漠藜苜蓿 EST序列，在BioEdit软件中用蒺藜苜蓿EST序列文本文件与数据库中已知的拟南芥AtZFP序 列进行Local Blast，从而获得蒺藜苜蓿中ZFP基因的EST序列。利用该序列设计引物，引物 为： ZFP-F1:5 '-ACCAAGTCACCAACTCAATC-3 ' ZFP-R1:5 '-ACCGTTTCATTGTCTTC-3 '； 具体流程如下： 总RNA提取和cDNA合成：利用TRIZ0L试剂盒提取紫花苜蓿叶片RNA，反转录为cDNA，并以合成的cDNA为模板 进行PCR扩增，得到MsZFP全长序列。 用KOD-plus本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种紫花苜蓿抗寒基因MsZFP，其特征在于，该抗寒基因MsZFP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭长虹，陈月，宋丽莉，崔慧萍，张雪，
申请(专利权)人：哈尔滨师范大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。