本发明专利技术公开了一种基于末端延伸、金纳米粒子和氧化还原酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法。首先在金电极表面修饰一层巯基修饰的捕获探针分子用于捕获目标DNA分子，目标DNA分子被捕获探针捕获之后，信号探针修饰的金纳米粒子与目标DNA分子的另一端碱基互补配对修饰到电极表面，然后在末端延伸酶的催化作用下将生物素标记的脱氧核糖核苷酸延伸到信号探针的3’端，延伸过程中引入的生物素与亲和素标记的辣根过氧化物酶特异性结合，辣根过氧化物酶被修饰到电极表面，通过检测辣根过氧化物酶催化电解液产生的电化学信号的变化来实现对目标DNA分子的高灵敏度、高特异性检测，可用于分子识别、临床诊断、环境监测及食品安全等领域中DNA样品的检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种基于末端延伸、金纳米粒子和氧化还原酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法。首先在金电极表面修饰一层巯基修饰的捕获探针分子用于捕获目标DNA分子，目标DNA分子被捕获探针捕获之后，信号探针修饰的金纳米粒子与目标DNA分子的另一端碱基互补配对修饰到电极表面，然后在末端延伸酶的催化作用下将生物素标记的脱氧核糖核苷酸延伸到信号探针的3’端，延伸过程中引入的生物素与亲和素标记的辣根过氧化物酶特异性结合，辣根过氧化物酶被修饰到电极表面，通过检测辣根过氧化物酶催化电解液产生的电化学信号的变化来实现对目标DNA分子的高灵敏度、高特异性检测，可用于分子识别、临床诊断、环境监测及食品安全等领域中DNA样品的检测。【专利说明】一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法
本专利技术属于电化学生物传感器研究领域，涉及一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶催三级放大电化学传感器检测DNA的方法。
技术介绍
DNA检测在分子识别、临床诊断、环境监测、食品安全等方面得到了广泛应用。而实际样本中所需要检测的DNA的浓度往往很低，设计和研究具有高灵敏度和选择性的传感器就成为了研究的重点。为了提高DNA检测的灵敏度，各种信号放大策略也应运而生，其中包括核酸扩增信号放大策略，纳米材料信号放大策略和酶催化信号放大策略等。目前常用的核酸扩增技术了有聚合酶链式反应、滚环复制扩增和一些其他的等温核酸扩增技术。但是聚合酶链式反应技术需要严格控制温度的变化，而且需要比价复杂的反应仪器，成本较高；而滚环复制扩增过程也需要加入反应模版，从而增加了反应体系的复杂程度，也提高了成本。为了避免这些问题，一种新的核酸扩增技术表面诱导末端延伸技术应运而生，这种在末端延伸酶的催化作用下无需模版在核酸链的3’端延伸核酸长链的放大技术得到了广泛的应用。纳米材料因为其特有的尺寸性质，在信号放大策略中得到广泛应用。金纳米粒子有高的表面体积比、制备工艺较成熟、稳定性好、生物相容性好，易于功能化(特别是可以通过金-硫键将DNA修饰在金纳米粒子表面)等优点，在DNA的检测中作为信号放大材料得到广泛应用。酶的催化作用能够在引入一个酶分子的情况下催化多个底物的反应而使信号得到放大，也在信号放大策略中扮演着不可忽视的角色。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了尚灵敏和尚选择性地检测痕量的DNA片段，包括完全互补、单个碱基错配、两个碱基错配、三个碱基错配、完全非互补序列和血清样本中的DNA片段，提供一种基于末端延伸放大、金纳米粒子和酶催化三级放大电化学传感器检测DNA的方法。实现本专利技术目的的技术解决方案为:一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，包括如下步骤:步骤一、Au-DNA溶液的制备:在金纳米粒子溶液中缓慢加入5’端被标记的巯基标记信号探针溶液，反应后陈化，然后离心、洗涤、离心、重悬；步骤二、电化学传感器的制备:(a)金电极的清洗:以NaBH4S液浸泡后打磨，然后超声清洗；(b)自清洁表面:室温下在金电极表面自组装3’端标记巯基的捕获探针溶液，然后用HS- (CH2) n-EG2-0H室温下浸泡封闭，得到自清洁表面；(c) Au-DNA的修饰:目标DNA滴加到自清洁表面反应I小时后，滴加Au-DNA溶液；(d)末端延伸:在末端延伸酶的作用下，在步骤(c)修饰到金电极表面的信号探针的3’端延伸生物素标记的核酸长链，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶反应15min，通过生物素-亲和素相互作用引入辣根过氧化物酶制得电化学传感器；步骤三、电化学信号检测:将制备完成的电化学传感器放在三电极体系中以循环伏安法和时间电流曲线法进行检测，得到电化学信号。步骤一中采用的重悬溶剂为PBST溶液，其中金纳米粒子的粒径为30nm，其溶液浓度为lnmol/L ;巯基标记信号探针的溶液浓度为3.3 μ mol/L。步骤二(b)中捕获探针的浓度为0.5 μ mol/L,自组装时间大于4小时；HS- (CH2) n-EG2-0H浓度为0.5mmol/L，浸泡时间大于4小时。步骤二(c)中Au-DNA溶液的浓度为0.5nmol/L，修饰时间为I小时。步骤二(d)中末端延伸酶的浓度为1U，生物素标记的核苷酸(底物)为生物素标记的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，浓度为5.7 μπιοΙ/L，延伸时间为I小时。步骤三中的电化学检测体系为三电极体系，工作电极为金电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极，其中，电解液为3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液，循环伏安法高电位为0.7V，低电位为0V，扫描速度为0.lV/s ;时间电流曲线法的扫描电位为0.1V，扫描时间为100s。步骤一和二中所述DNA序列如下:所述的5’端被标记的巯基标记信号探针序列为:5’-GAA ACC CTA TGT ATG CTC-SH-3’;所述的3’端标记巯基的捕获探针序列为:5’-SH_TTTT TTT TTT GTA TGA ATT ATA ATC AAA-3’ ；所述的目标DNA序列如下:完全互补序列GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTA TAA TTC ATA C、单个碱基错配序列5’-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATA C-3’、两个碱基错配序列 5，-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TAT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATA C-3，、三个碱基错配序列 5’ -GAG CAT GCA TAG GGT TTC TAT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATAC-3’或完全非互补序列 5，-ATCATC GAT ATC GTT CGA TAT CGT TAT CGA TTA TCG TTA TCATCG A-3，。本专利技术与现有技术相比，具有以下特点:1、检测灵敏度高:本专利技术对DNA的检测下限低于10fM，在现有的DNA检测传感器中处于较高的灵敏度水平。2、检测的范围宽:本专利技术对DNA的检测范围宽度大于8个数量级，在现有的DNA传感器中处于较宽的检测宽度。3、检测体系简单:本专利技术使用的检测方法为简单的电化学检测，对样本的颜色没有要求，灵敏度高，并且易于简单化和微型化。4、实际应用性强:本专利技术的DNA传感器在模拟的血清样本中仍然具有较高的检测信号，说明本传感器在实际样本中的应用性强，有很高的临床诊断方面应用前景。【附图说明】图1是本专利技术基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法的过程示意图。图2是本专利技术实施例1中的Au-DNA制备结果，图a为修饰信号探针前的吸光度曲线，b为修饰信号探针后的吸光度曲线。图3是本专利技术实施例2-4中的条件优化结果图(其中A为实施例2，B为实施例3，C为实施例4) ο图4是本专利技术实施例5中的对不同浓度目标DNA的电流图。图5是本专利技术实施例6中的对完全互补及对照DNA片段检测电流对比图。图6是本专利技术实施例7中在缓冲溶液和血清中目标DNA检测电流对比图。【具体实施方式】下面通过实施例对本专利技术作进一步的说明，其目的是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、Au‑DNA溶液的制备：在金纳米粒子溶液中缓慢加入5’端被标记的巯基标记信号探针溶液，反应后陈化，然后离心、洗涤、离心、重悬；步骤二、 电化学传感器的制备：（a）金电极的清洗：以NaBH4 溶液浸泡后打磨，然后超声清洗；（b）自清洁表面：室温下在金电极表面自组装3’端标记巯基的捕获探针溶液，然后用HS‑(CH2)11‑EG2‑OH室温下浸泡封闭，得到自清洁表面；（c）Au‑DNA的修饰：目标DNA滴加到自清洁表面反应1小时后，滴加Au‑DNA溶液；（d）末端延伸：在末端延伸酶的作用下，在步骤（c）修饰到金电极表面的信号探针的3’端延伸生物素标记的核酸长链，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶反应15min，通过生物素‑亲和素相互作用引入辣根过氧化物酶制得电化学传感器；步骤三、电化学信号检测：将制备完成的电化学传感器放在三电极体系中以循环伏安法和时间电流曲线法进行检测，得到电化学信号。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：万莹，王鹏娟，苏岩，杨树林，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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