片段化交联DNA的快速分离与检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开一种片段化交联DNA的快速分离与检测试剂盒及方法，该试剂盒包括用于片段化DNA解交联与分离提取的试剂，所述试剂为Chelex100。所述试剂盒可以进一步包括蛋白降解试剂、分子量标记物、加样承载缓冲液和/或降解RNA的试剂。Chelex‑100能够整合多价金属离子，具有较高的金属离子选择性和结合力，能够分离DNA，并防止DNA降解。本发明专利技术的一种片段化的交联DNA的快速分离检测方法，可通过快速质控超声片段化的效果，决定待检样品是需要继续超声，还是可用于下一步沉淀实验；或用于多个待检样品超声优化，以选择最佳条件。实现用于染色质免疫沉淀(ChIP)等技术中染色质超声片段化样品质量的快速检测，能够极大地提高了ChIP的成功率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及片段化DNA的质控。更具体地，涉及一种片段化交联DNA的快速分离与检测。
技术介绍
染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是目前研究体内蛋白质与DNA相互作用的唯一方法，在基因表达调控研究中起着无可替代的作用。真核生物的基因组DNA与组蛋白等相互作用构成染色质，是遗传物质的载体和存在形式。研究染色质中蛋白质与DNA相互作用是阐明基因表达调控机制的基本途径。ChIP的基本原理是在活细胞状态下通过福尔马林固定DNA－蛋白质复合物，超声随机剪切形成染色质小片段，经目的蛋白特异性的抗体沉淀，特异性富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内转录调控蛋白与DNA的动态相互作用，还可以用来研究染色体组蛋白修饰与基因表达及活性的关系，已广泛用于转录调控蛋白靶基因的高通量筛选，如ChIP-on-chip,ChIP-seq等。染色质通过超声随机剪切形成染色质小片段，即染色质DNA超声片段化是ChIP过程中最为关键的步骤之一，也是最难控制的一个技术环节。超声片段化效果取决于超声功率的大小、超声时间的长短，样品染色质DNA的浓度、裂解程度、容量，甚至超声探头深入样品液面多少都会影响超声片段化的效果，因此即使是优化好的同一条件，在同一时间对不同的样品，或不同时间对相同的样品都会产生不同的结果。而且超声功率过大、或超声时间过长，会引起样品液体产生泡沫而影响超声效果，或导致样品中蛋白质变性失活，或导致染色质DNA片段过短。反之，超声功率过小、或超声时间过短，会导致样品中染色质DNA片段过长，影响染色质DNA的沉淀效果，导致非特异性增加。染色质免疫共沉淀反应之前需要检测染色质DNA超声片段化效果，优化染色质剪切条件。因此，染色质DNA超声片段化的检测至关重
要。由于染色质DNA超声片段化的过程是不可逆的，因此，人们倾向于减小输出功率、延长超声时间进行优化，但目前的检测方法，都必须经过4小时以上解交联过程，并经过繁琐(酚氯仿)或昂贵(试剂盒)的DNA片段分离纯化，费时超过1天，而且因为回收效果的问题，不能忠实、精确反映待检样品DNA片段的实际大小(图1)。在染色质DNA超声片段化的的质检过程中，样本或冻存、或继续加入抗体沉淀，如果超声片段化的效果不佳(如DNA片段过长)，待检样品或被废弃(因冻存无法再进行超声片段化处理)，或即使已加入抗体沉淀也不得不终止反应废弃。因此，急需一种快捷的质控超声片段化效果的检测试剂盒和方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种片段化交联DNA的快速分离检测试剂盒。本专利技术解决的第二个技术问题是提供一种片段化交联DNA的快速分离检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用下述技术方案：一种片段化交联DNA的快速分离与检测试剂盒，该试剂盒包括用于片段化DNA解交联与分离提取的试剂，所述试剂为Chelex 100。所述试剂盒进一步包括蛋白质降解试剂，所述蛋白质降解试剂选自能够降解组蛋白的蛋白酶。优选地，所述蛋白酶是ChIP级蛋白酶。优选地，所述蛋白酶选自蛋白酶K、胰蛋白酶和组织蛋白酶中的一种或多种。其中所述蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶。所述胰蛋白酶是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。组织蛋白酶是来源于各种动物组织的细胞内的一类由组织蛋白酶A、B、C、D和/或E等多种酶组成的蛋白酶。所述试剂盒进一步包括加样承载缓冲液，所述加样承载缓冲液可选自但不限于商业出售的加样承载缓冲液。优选地，所述加样承载缓冲液包括示踪核酸分子电泳迁移速度的染料，优选地，所述染料分子量相当于50-400bp的DNA，更优选地，所述染料分子量相当于50-150bp的DNA，更优选地，所述染料分子量相当于50bp的DNA。为避免常规的DNA的加样缓冲液颜色因与DNA片段重叠造成的遮盖干扰。所述染料选自但不限于二甲苯蓝、甲酚红、溴酚蓝、橙黄G和柠檬黄中的一种或多种。所述试剂盒进一步包括分子量标记物(DNA ladder marker)，用于DNA凝胶电泳时指示待测样本的分子量。所述试剂盒进一步包括RNA降解试剂。所述RNA降解试剂用于降解样品中的RNA，减少RNA对待检测DNA的干扰。所述RNA降解试剂选自但不限于商业出售的相关试剂，如RNaseA或RNase H。所述Chelex 100是一种微珠，一直作为微量DNA的提取试剂来应用，未曾用于片段化的交联DNA的分离，申请人发现特殊的条件下，Chelex 100能够将片段化的交联DNA与蛋白质分离，特别是能够将片段化的交联染色质DNA与蛋白质分离。优选地，所述试剂盒中，Chelex 100的浓度为2-40％(g/mL)，优选地为浓度为10％(g/mL)，即100ml溶液中含有10g Chelex 100，其中所述溶液为能够发挥并稳定Chelex 100的理化性质，同时抑制细菌或真菌产生和生长的常规溶液，如20％乙醇溶液。一种片段化交联DNA的快速分离与检测的方法，该方法包括如下步骤：在样品中加入蛋白质降解试剂，孵育；添加片段化DNA解交联与分离提取的试剂，震荡；高温震动孵化；离心留取上清；加样承载缓冲液至上清中；电泳检测。优选地，所述震荡时间为5-30s，更优选地，震荡时间为10s所述高温震动孵化条件为80-100℃，100-1500转/分，5-30min，优选地，所述高温震动孵化条件为95℃，500转/分，10min。所述快速分离检测方法进一步包括将上清转入新的管中。所述快速分离检测方法进一步包括加入RNA降解试剂，优选地，且加入RNA降解试剂后孵育，优选地于室温孵育。所述电泳检测是进行凝胶分析或快速凝胶分析，优选地用1.2％凝胶进行电泳分析。本专利技术的有益效果如下：申请人首次通过一种较高的金属离子选择性和较强的结合力化学整合树脂Chelex-100，进行DNA分离，并通过优化探索，专利技术一种片段化的交联DNA的快速分离检测方法，可通过快速质控超声片段化的效果，决定待检样品是需要继续超声，还是可用于下一步沉淀实验；或用于多个待检样品超声优化,选择最佳条件。本专利技术方法为染色质DNA超声片段化这一ChIP过程中最为关键、也是最难控制的一个技术环节提供快速有效的质控检测，不仅
节省样本资源，而且能够极大地提高ChIP的成功率。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1示出凝胶电泳分析新专利技术方法分离的片段化DNA。具体实施方式为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例和附图对本专利技术做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。实施例1：实验方法建立1.染色质DNA超声片段化步骤：1)制备细胞裂解液，转移10μL细胞裂解液至1.7μL微型离心机管(EP管)，标记为S0；2)DNA片段化条件：使用Sonicator 3000(MISONIX,Part#S3000)超声仪的1/16英寸探针进入细胞裂解样品液面下2-3毫米的深度。超声裂解样品中染色质DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种片段化交联DNA的快速分离与检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括用于片段化DNA解交联与分离提取的试剂，所述试剂为Chelex 100。

【技术特征摘要】
1.一种片段化交联DNA的快速分离与检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括用于片段化DNA解交联与分离提取的试剂，所述试剂为Chelex 100。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Chelex 100的浓度为2-40％(g/mL)。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括蛋白质降解试剂。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白降解试剂选自蛋白酶K、胰蛋白酶(Trypsin)和组织蛋白酶(cathepsin)中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括加样承载缓冲液，所述加样承载缓冲液包括示踪核酸分子的染料。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述染料分子量相当于50-400bp的DNA；优选地，所述染料分子量相当于50-150bp的DNA，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄家强，景坤玉，林舒晔，林博楠，
申请(专利权)人：北京交通大学，黄家强，
类型：发明
国别省市：北京;11