细胞功能的微分析制造技术

倒置微孔(102)提供了一种用于筛选生物粒子(128)的快速和有效的微分析系统(100)和方法，特别是基于单个细胞的细胞功能分析。使用倒置开放微孔系统(102)可以在同一微孔内鉴定可联合产生所需功能效应的粒子，细胞和生物分子，也允许对分泌抗体的治疗活性进行功能筛选，并具有重获细胞和液体、选择性地扩增细胞如抗体分泌细胞的潜能。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2011年12月5日，申请号为201180066877.5，专利技术名称为“细胞功能的微分析”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2010年12月3日提交的，名称为“细胞功能的微分析”的美国临时申请号为61/419,377的权益，其用于所有目的的全部内容通过引用方式并入到本文中。
技术介绍
需要高通量、有效分析包括单个活细胞在内的生物粒子的系统，以能够快速和有价值地鉴定包括细胞、分子等在内的粒子，所述粒子具备所需功能，如产生或诱导所需的生物结果。新药研发、诊断、候选分子的筛选等需要这种系统。在优选系统中，所述粒子可保留其活性，所述分析过程对其无明显损伤。评估单个粒子的现有系统通常使用介电泳(DEP)来操纵粒子。将电场强加于粒子如细胞上，以在诱导反应期间使该粒子悬浮并维持粒子的位置，并且，分析可损伤其活性，并破坏粒子行驶正常功能的能力。例如，在长时间使用的情况下，这种损伤可以导致溶解和/或细胞死亡。粒子与基板、电极或室壁的黏附可能也需要所述细胞的溶解以在分析后将该细胞从系统中移除或者以捕获细胞产物。提供一种用于有效且高效地捕获、鉴定以及并且分析单个粒子的生物功能的快速、高通量的系统是非常有用的，其中该系统对所述粒子无明显损伤。
技术实现思路
本文公开了倒置开放微孔系统、装置及使用方法，可以对粒子特别是包括单个细胞在内的单个粒子进行快速、有效地筛选和分选。这种筛选包括对可指示粒子或试剂是否可用于治疗用途的粒子的特定粒子特征以及功能特性的分析。例如，所述的粒子特征可以包括：配体如癌细胞靶抗原的特异性结合和/或亲和
力的存在及相对量；细胞与细胞间的结合反应及相互作用，如细胞溶解，毒性，生物标志物产生，电穿孔等；诱导的细胞响应和/或反应，如由其他细胞，药物，化合物，蛋白，抗体，分子，酶，核酸分子，细胞分泌物等所诱导的；细胞产物如分解酶，抗体，生物标记等的诱导产生。这些特征的分析以及随后的粒子重获支持功能性细胞分选的方法，该方法导致具有已被证实的功能和效用如治疗效用的细胞或其副产物(如分泌的分子)的分离。在一个实施方式中，所述单个细胞分析可以包括基本属于一个反应方案的多个试验或者连续地，如其结果是一个试验为接下来的特定试验提供信息的多个试验。比如，已知与特定疾病相关的细胞，比如，从患所述疾病的个人获得的细胞，可在该系统中进行分析，以确定特定生物标志物如抗原，表达蛋白或疾病特征的存在。在鉴定所述单个细胞是否显示所述生物标志物的初步分析之后，该同一个被鉴定的细胞可用于再次分析其对于候选治疗药物，化合物，或者预期在表现所筛选的生物标志的细胞内有效诱导所需响应的其它细胞治疗的响应。在该倒置开放微孔中的分析可在单个粒子(包括单个细胞)上完成，且具有快速、有效的时序，而无需将该粒子或该粒子的产物从复杂混合物中分离。筛选方法包括筛选功能特性的单个细胞，并选择基本存活的原始细胞，以进行后续的分析，永生化和/或被认为具有有用特性的克隆扩增。细胞成分如DNA,RNA,蛋白质等，也可以从该原始细胞中分离出来。在开发过程的早期，该方法能够鉴定所需的粒子反应和粒子相互作用。对于细胞功能的早期理解，使得在对材料的成功潜能有了更好理解的基础上，最终开发出有用的生物材料成为可能，并可减少开发过程更早期的潜在候选者的数目。对于同一个粒子如对于单个细胞可实施多重、快速分析的方法，并获得探索过程中更快速的进展。本文所述的倒置开放微孔系统有助于将单个细胞精确传递到微孔或者被微孔排除，并且精确操控微通道中和特定微孔中的细胞和其它粒子，传递试剂、
缓冲液、标记物等，包括用于细胞-细胞相互作用的其它细胞。可以对单个细胞的多个特征进行评估，同时保留其在开放微孔中的活性以进行可选的后续试验、永生化、扩增等。在很短的时间框架内可以重获粒子(包括重获原始的单个细胞)，使用最少的反应试剂并且重获基本存活和有用的情况中的细胞和产物。特别是，一个或多个粒子(包括活细胞)在开放微孔的流体/空气界面的沉积，允许可有效监视并且快速筛选的精确的粒子与粒子相互作用鉴定候选粒子如细胞，便于在微孔中进行后续的分析和/或克隆扩增。出人意料地，当使用适当的几何约束和流体条件时，填充具有对空气开放的下部末端108的倒置开放微孔102的流体在不从下部开放末端泄漏的情况下被保留。此外，在流体洗涤期间，所沉积的粒子128出人意料地被保留在弯月面122，而将其它粒子放置在靠近所述第一个的位置和分析程序。所述开放微孔用作“微型离心机”，该微型离心机可将试剂传递至所沉积的粒子以在没有损失的情况下对所沉积粒子进行快速分析、洗涤以及后续分析。比如，在分析之后以及当从微孔重获时，微孔中的细胞可以保持较好的活性。比如，可从微孔重获到基板如微量滴定板上，以进行如永生化和/或扩增。在一个实施例中，可以在微孔中孵育并且扩增所选单个细胞。本专利技术提供了实现倒置微孔系统的方法和结构，所述倒置微孔系统包括上部末端对微通道开放的微孔。在一个实施例中，可在下部末端将所述微孔封闭，优选使用透明材料如玻璃或透明聚合物使允许看到所述微孔中的内容物。在另一个实施例中，所述微孔在下部末端对装置外的大气(atmosphere)(如空气或其它气体)开放。例如，可以通过沉降，由细胞密度，流体速度，加载时间和可选择地介电泳力控制将一个或多个粒子传递到微孔。介电泳力可由与适当的交流电压相连并布置在微通道中的电极生成，该微通道定位于对该微通道开放且流体相通的微孔的上面。本文还提供了比如由嵌入到开放微孔内的电极所控制的有效的粒子聚集和相互作用以产生能操纵粒子如单个细胞到微孔内的所需位置的介电泳力
的方法。该方法提供了使用最小量的试剂并允许高通量地重获分析后的活性粒子(包括细胞和细胞产物)的高通量分析系统。本专利技术还提供了精密控制和分选粒子(包括细胞和非细胞粒子)的方法和结构，以将粒子有效地传递到所述倒置开放微孔系统的微孔。具体的实施例包括将电极和电极对配置在微通道中，使粒子能够在对生物材料如细胞的活性具有较小或没有伤害的情况下移动；将电极和电极对配置在微通道中并且接近微孔，允许所需粒子到微孔的所控制的访问并且有效封闭微孔和驱离不需要的粒子的结构；和电极和电极对在微孔中的模式，用于检测和可选择地控制粒子进入和经过微孔时粒子的位置，比如，沉积在流体弯月面上。所述倒置开放微孔系统包括一个(图1)或多个(图3)微孔，其中每个微孔与一个或与多个微通道流体连通，以将流体和粒子传递到所述一个或多个微孔。所述微通道通常配置在所述微孔的上方，所述微孔在微孔的上部末端106对流体微通道开放，在下部末端108对装置外的大气(如空气或其它气体)开放，可以控制大气特性(如气体组分、湿度、温度和不存在污染物)。所述微孔具有延伸在所述微孔102的上部末端106和下部末端108之间的一个垂直轴110(如中心垂直轴)。在一个实施例中，所述微孔102的垂直壁112至少一部分由介电材料114形成。所述垂直壁还可以至少一部分由与介电材料集成的一个或多个电极形成，例如，在与孔的垂直轴垂直的层状结构中，层压板形成所述微孔，比如，如图2所示。注入微通道104中的流体在毛细管作用下填充微孔102，同时表面张力将所述流体保持本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于对粒子功能进行微分析的倒置微孔系统，其包括：a)具有流体入口和流体出口的微通道，其中，所述微通道被配置成允许流体在流体入口和流体出口之间流动；b)具有开放上部末端和下部末端的至少一个微孔，所述上部末端对所述微通道开放，所述微通道便于流体输送至所述微孔；c)在所述流体入口和所述至少一个微孔之间，沿着所述微通道布置的受控的电极阵列，其中所述电极阵列包括沿着垂直于所述微通道中的流体流的轴线(B‑B’)放置的多个上游电极，所述多个上游电极至少包括第一上游电极(153)，第二上游电极(154)，第三上游电极(155)和第四上游电极(156)，所述多个上游电极至少部分嵌入基板(114)中以使得所述多个上游电极的相邻电极被所述基板(114)的部分彼此分开，其中所述第三上游电极(155)定位于所述第一上游电极(153)上方，所述第四上游电极(156)定位于所述第二上游电极(154)上方，并且所述第一上游电极(153)面向所述第二上游电极(154)，以及所述第三上游电极(155)面向所述第四上游电极(156)。

【技术特征摘要】
2010.12.03 US 61/419,3771.一种用于对粒子功能进行微分析的倒置微孔系统，其包括：a)具有流体入口和流体出口的微通道，其中，所述微通道被配置成允许流体在流体入口和流体出口之间流动；b)具有开放上部末端和下部末端的至少一个微孔，所述上部末端对所述微通道开放，所述微通道便于流体输送至所述微孔；c)在所述流体入口和所述至少一个微孔之间，沿着所述微通道布置的受控的电极阵列，其中所述电极阵列包括沿着垂直于所述微通道中的流体流的轴线(B-B’)放置的多个上游电极，所述多个上游电极至少包括第一上游电极(153)，第二上游电极(154)，第三上游电极(155)和第四上游电极(156)，所述多个上游电极至少部分嵌入基板(114)中以使得所述多个上游电极的相邻电极被所述基板(114)的部分彼此分开，其中所述第三上游电极(155)定位于所述第一上游电极(153)上方，所述第四上游电极(156)定位于所述第二上游电极(154)上方，并且所述第一上游电极(153)面向所述第二上游电极(154)，以及所述第三上游电极(155)面向所述第四上游电极(156)。2.根据权利要求1所述的倒置微孔系统，其还包括至少部分围绕所述至少一个微孔的一对面向电极(116,116A)，所述第三电极(155)在所述面向电极对的第一面向电极(116)上方的位置，而所述第四上游电极(156)在所述面向电极对的第二面向电极(116A)上方的位置。3.根据权利要求1所述的倒置微孔系统，其还包括至少部分围绕所述至少一个微孔、如此成形以使其提供面向所述流体入口的开口的至少一个附加电极(116)，所述第三和第四上游电极(155)和(156)在所述附加电极(116)上方的位置。4.根据权利要求1至3任一项所述的倒置微孔系统，其沿着所述微通道还包括：包含四个下游电极(170,171,172,173)的结构，其相对于沿着所述微通
\t道的流体流位于所述第一和第二上游电极(153,154)的下游，相对于沿着所述微通道的流体流，其中所述下游电极和所述第一和第二上游电极平行于所述微通道中的流体流布置，并且所述下游电极和所述第一和第二上游电极位于所述微通道的底部上。5.根据权利要求1至3任一项所述的倒置微孔系统，其沿着所述微通道还包括：包含三个检测电极(174,175,176)的结构，其相对于沿着所述微通道的流体流位于所述第一和第二上游电极(153,154)的下游，其中所述检测电极和所述第一和第二上游电极(174,175,176,153,154)放置于与所述微通道中的流体流平行的轴线(F-F’)上，并且所述检测电极和所述第一和第二上游电极(174,175,176,153,154)位于所述微通道的底部上。6.根据权利要求1所述的倒置微孔系统，其中所述至少一个微孔具有开放下部末端并且在所述下...

【专利技术属性】
技术研发人员：马西莫·博基，罗伯托·圭列里，
申请(专利权)人：塞普莱有限公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT