一种多能干细胞定向分化为功能性心肌的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于从多能干细胞中生产生物工程化心肌(BHM)的方法，所述方法通常包括，通过定向组织形成，诱导中胚层分化、心肌分化和心肌成熟的步骤。该方法是一种稳健的、无血清的且可再生的生产用于多种应用的BHM的途径，并且可应用于多种多能干细胞系。本发明专利技术还涉及通过本文公开的方法生产的BHM，以及所述BHM在药物和毒性筛选中的用途，和其在医药中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
如今人多能干细胞(hPSC)广泛地用于提供理论上无限的且同时大量供应的人心肌细胞(Kehat等，J Clin Invest 108,407-414(2001)；Takahashi等，Cell 131,861-872(2007)；Zhang等，Circ Res 104,e30-41(2009))。人心肌细胞源自人胚胎干细胞(hESC)(Thomson等，Science 282,1145-1147(1998))和诱导多功能干细胞(hIPSC)(Takahashi等，Cell 131,861-872(2007))，并且人心肌细胞具有包括发育模型(Lian等，Stem Cells 2012(2012))、药物疗效和/或安全性筛选(Schaaf等，PLoS ONE 6,20(2011))、肥厚建模和再生应用的已证明的多目的用途。此外，对于hIPSC技术的最新进展，可以在体外产生显示遗传性基因疾病表型的心肌细胞(Carvajal-Vergara,X.等，Nature465,808-812(2010)；Itzhaki等，Nature 471,225-229(2011)；Malan等，Circ Res(2011)；Moretti等，N Engl JMed 363,1397-1409(2010)；Yazawa等，Nature 471,230-234(2010))。目前普遍认为，源自活检的人心肌细胞的低密度2D培养会导致心肌细胞表型和形态的快速改变(Bird等，Cardiovasc Res 58,423-434(2003))，从而使其体内状况结果的推断变得困难。为了获得更能代表体内条件的心肌细胞表型，采用心肌组织工程(Eschenhagen等，FASEB J 11,683-694(1997)；Zimmermann等，Biotechnol Bioeng 68,106-114(2000)，Zimmermann等，Circ Res 90,223-230(2002)；Tulloch等，Circ Res 109,47-59(2011)；Tiburcy等，Circ Res 109,1105-1114(2011)；Eschenhagen等，Am J PhysiolHeart Circ Physiol 303,11(2012))来产生与自然的心肌组织具有类似性质的构建体。组织工程目前的观念学是产生/分离所需的一种或多种细胞类型，并将这些细胞类型接种于工程化的环境中从而促进其分化并产生体内样组织。因此，组织工程可被认为是一个低效过程的原因有两个：1)组织/分化培养物的分离破坏了胞外环境，从而破坏发育信息(如细胞-细胞的互联性、几何细胞定位、细胞-ECM的连通性)，为了重新建立环境，需要细胞外基质(ECM)生产的大量增加(Hudson等，Tissue Eng Part A 17,2279-2289(2011))；和2)hPSC细胞系间的分离过程是可变的，并能导致大量的细胞死亡。文献中报道的其它试验方案可能需要对试验方案进行修改从而实现多个hPSC细胞系中相似的心肌细胞效率。然而，专利技术人得到的结果证明分化试验方案的改变可极大地影响心肌细胞的表型(如证明dorsomorphin可极大地影响生物工程化心肌(BHM))。这可导致组织工程化心肌性能改变，从而可掩盖不同实验条件或遗传性疾病模型的效果，因此当在不同细胞系中应用不同试验方案时必须小心。一些近期公开的试验方案实现了将相同的试验方案应用于多个细胞系，它们还能产生高纯度的心肌细胞。然而，纯的心肌细胞不能促进功能性组织工程化心肌的形成，并且功能性组织工程化心肌的形成需要心肌细胞和基质细胞两者(Naito等，Circulation 114,I72-78(2006)，Hudson等.Tissue Eng Part A 17,2279-2289(2011))。因此，本领域仍然需要能够克服上述缺点的用于生产生物工程化人心肌的方法。稳健的分化试验方案的开发是允许持续生产BHM的非常重要的步骤。在本研究的＞18个独立实验中产生了n＞140BHM，并且每个BHM都表现出自发搏动活动。此外，该试验方案实现了采用相同的试验方案从多个hPSC细胞系生产BHM。另外，能免除所有的分离步骤，使hPSC直接分化为生物工程化心肌，因而保留了组织的发育记忆、防止了任何组织重建响应并提供更精确的人心肌发育的体外模型。专利技术概述本专利技术涉及一种用于从多能干细胞生产生物工程化心肌的方法，所述方法包括如下步骤：(i)在基础培养基中培养多能干细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)BMP4、激活素A、FGF2、GSK3-抑制剂，和(b)得到终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml L-肉碱HCl、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)的无血清补充剂，由此诱导所述多能干细胞的中胚层分化；(ii)在基础培养基中培养步骤(i)中得到的细胞，所述基础培养基包含有效量的Wnt-信号传导通路抑制剂和如步骤(i)中的无血清补充剂，由此诱导所述细胞的心肌分化；和(iii)在机械刺激下，在基础培养基中培养步骤(ii)中得到的细胞，所述基础培养基包含有效量的如步骤(i)中的无血清补充剂，由此促进心肌成熟。实施本专利技术所公开的方法，通过在胶原蛋白水凝胶中hPSC的定向组织形成产生源自人多能干细胞(hPSC)的生物工程化心肌(BHM)。为了形成BHM，采用定向无血清诱导试验方案来模拟体内发育，该试验方案使组织发展通过不同的、已知的发育阶段，通过多能性、早期中胚层、心肌祖细胞、未成熟心肌细胞和最终成为较成熟的心肌组织，该组织包含50％心肌细胞，剩余主要为基质细胞部分(fraction)而。专利技术人优化了其无血清BHM试验方案并发现个别BHM性能高度依赖于特定刺激，因此表明最佳BHM性能需要多个外源刺激。最终，产生了可节律性收缩的BHM，其具有可测量的收缩力，响应增加的静息长度、钙浓度和β-肾上腺素能刺激而起博和收缩的能力。这一BHM试验方案无需修改即可持续从多个hPSC细胞系生产BHM(每个进行的实验中的每个BHM)。本专利技术的数据表明本文公开的BHM试验方案是一种稳健的、无血清的和重现性好的生产用于多种用途的人心肌的方法。例如，还证明了BHM是一个有潜力的人心肌发育模型，并表明BMP信号传导的抑制导致了具有降低的收缩强度的较不成熟的心肌表型。因此，本专利技术还涉及采用根据本专利技术所述的方法生产的BHM。进一步考虑的是根据本专利技术的BHM在用于药物毒性筛选的体外模型中的用途。换言之，本专利技术还涉及一种用于筛选药物毒性的方法，所述方法包括使根据本专利技术的BHM与待筛选的药物接触的步骤。此外，本专利技术涉及根据本专利技术的BHM在用于测试药物候选试剂的心肌功能调节的体外方法中的用途。因此，本文还描述了一种用于测试心肌功能调节的方法，所述方法包括使根据本专利技术的BHM与药物候选试剂接触的步骤。最后，本专利技术还涉及根据本专利技术的BHM作为研究工具的用途，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从多能干细胞生产生物工程化心肌的方法，所述方法包括如下步骤：(i)在基础培养基中培养多能干细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)BMP4、激活素A、FGF2、GSK3‑抑制剂，和(b)得到终浓度为0.5‑50mg/ml白蛋白、1‑100μg/ml转铁蛋白、0.1‑10μg/ml乙醇胺、0.003‑0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4‑40μg/ml L‑肉碱HCl、0.1‑10μg/ml氢化可的松、0.05‑5μl/ml脂肪酸补充剂、0.0001‑0.1μg/ml三碘‑L‑甲状腺原氨酸(T3)的无血清补充剂，由此诱导所述多能干细胞的中胚层分化；(ii)在基础培养基中培养步骤(i)中得到的细胞，所述基础培养基包含有效量的Wnt‑信号传导通路抑制剂和如步骤(i)中的无血清补充剂，由此诱导所述细胞的心肌分化；和(iii)在机械刺激下，在基础培养基中培养步骤(ii)中得到的细胞，所述基础培养基包含有效量的如步骤(i)中的无血清补充剂，由此促进心肌成熟；其中，所述多能干细胞不是采用涉及改变人类种系遗传特性或涉及用于工业或商业目的的人胚胎的用途的工艺生产的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.20 EP 13185344.21.一种用于从多能干细胞生产生物工程化心肌的方法，所述方法包括如下步骤：(i)在基础培养基中培养多能干细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)BMP4、激活素A、FGF2、GSK3-抑制剂，和(b)得到终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml L-肉碱HCl、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)的无血清补充剂，由此诱导所述多能干细胞的中胚层分化；(ii)在基础培养基中培养步骤(i)中得到的细胞，所述基础培养基包含有效量的Wnt-信号传导通路抑制剂和如步骤(i)中的无血清补充剂，由此诱导所述细胞的心肌分化；和(iii)在机械刺激下，在基础培养基中培养步骤(ii)中得到的细胞，所述基础培养基包含有效量的如步骤(i)中的无血清补充剂，由此促进心肌成熟；其中，所述多能干细胞不是采用涉及改变人类种系遗传特性或涉及用于工业或商业目的的人胚胎的用途的工艺生产的。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞选自胚胎干细胞、诱导多能干细胞和孤雌生殖干细胞；和/或所述多能干细胞为灵长类动物来源的多能干细胞，优选地为人多能干细胞。3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中步骤(i)的基础培养基包含1-20ng/ml BMP4，优选地约5ng/ml BMP4；和0.1-10ng/ml FGF2，优选地约5ng/ml FGF2；和1-20ng/ml激活素A，优选地约9ng/ml激活素A。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(i)的基础培养基中的GSK3-抑制剂选自CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、Tideglusib、SB415286和LY2090314；优选地，步骤(i)的基础培养基包含0.1-10μM CHIR99021。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)的基础培养基中的Wnt-信号传导通路抑制剂选自IWP4，IWP2，IWR-1，IWP1，IWP3，IWR-2，IWR-3，IWR-4，IWR-5，XAV939，DKK1，槲皮素，ICG-001，扑蛲灵，CCT031374，iCRT-3、5、14，CPG049090和NC043；优选地，步骤(ii)的基础培养基包含0.1-10μM IWP4。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(iii)的基础培养基a)进一步包含0.1-10ng/ml TGF...

【专利技术属性】
技术研发人员：WH·齐默尔曼，J·哈德森，M·蒂布尔齐，
申请(专利权)人：修复股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE