本发明专利技术提供一种核苷磷酸化酶、编码基因及其高产菌株和应用，涉及生物制药技术领域。核苷磷酸化酶高产菌株，其分类命名为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)LK01，保藏编号为CCTCC NO: M 2015685。本发明专利技术还提供由所述菌株产生的核苷磷酸化酶及其编码基因。本发明专利技术还提供含有所述基因的重组表达载体或重组菌及其应用。采用本发明专利技术核苷磷酸化酶制备核苷类药物，反应条件温和，产物成分单一，无副产物，底物转化率较高，产物易于纯化，成功克服了目前化学法糖基化修饰核苷类药物存在的问题，具有很好的应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药
，具体涉及一种核苷磷酸化酶、编码基因及其高产菌株和应用。
技术介绍
天然核苷是由核糖或脱氧核糖与天然碱基所形成，由于天然碱基的多样性，构成的核糖核苷或脱氧核糖核苷也是种类繁多。天然核苷中的碱基或糖基经过化学修饰形成新的核苷，这种经过人工合成的核苷即为核苷类似物。核苷类似物与核苷酸在化学结构上具有类似性，可以假乱真混入DNA合成的过程中，但因其不具备核苷酸的功能，所以导致合成的核酸链失去了正常的功能。通过氮杂、脱氮、取代等化学修饰方法，对正常碱基的嘧啶和嘌呤进行修饰就可得到核苷类药物。核苷类似物在病毒或肿瘤细胞的遗传物质表达的过程中，被整合到DNA链中，不仅大大降低了聚合酶的活性，也终止了DNA的合成，从而使病毒细胞无法增殖传代，导致病毒的灭亡。因此，核苷类药物在治疗艾滋病毒、乙肝病毒、肿瘤等领域表现出极大的优势。据统计，在目前使用的抗病毒药物中有将近50％是核苷类药物。核苷类药物中的5-氟尿苷是一种重要的5-氟嘧啶类衍生物，可以制备多种抗癌抗病毒药物，特别是可以做为抗肿瘤新药氟铁龙(DFUR)的前体。氟铁龙(2'-deoxy-5-fluorouridine)为脲嘧啶类抗代谢物,属细胞周期特异性抗肿瘤药,可抑制胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶,阻断脲嘧啶脱氧核苷酸转变成胸腺嘧啶核苷酸,从而影响DNA的合成,起到抗病毒和抗肿瘤的作用。该药对多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用,临床上主要用于治疗肝癌、胃肠系癌、乳腺癌和头颈部肿瘤等,与常用抗肿瘤药物5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)相比,具有低细胞毒性和易于在体内被吸收的优点。现有技术中，常采用化学法糖基化得到脱氧氟尿苷，产物中会出现多种同分异构体，并且合成步骤繁多，需要对碱基或核糖基上的活性基团进行修饰保护，且合成过程中大量使用有机溶剂，同时还要使用毒性较大的氟化物、溴化物、重金属等，对环境造成巨大的污染。核苷磷酸化酶可以催化核苷或脱氧核苷的糖苷键的可逆磷酸化反应，提供核糖-1-磷酸，并释放碱基，加入其它碱基可形成另一种新的核苷。因此，核苷磷酸化酶主要用作酶法合成核苷类似物的工具。但是，现有核苷磷酸化酶的转化率较低，制备核苷类药物的成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种核苷磷酸化酶高产菌株，产生的核苷磷酸化酶能够高效制备核苷类似物。本专利技术的另一目的是提供核苷磷酸化酶及其编码基因，该酶能够用于高效制备核苷类似物。为了实现本专利技术的目的，本专利技术首先从本实验室耐有机溶剂菌库中筛选获得一株核苷磷酸化酶产生菌，分类命名为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)LK01，其保藏编号为CCTCCNO:M2015685。本专利技术对波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)LK01的生物学特性进行鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌，菌体的形态特征为杆状，细胞大小为(0.3～0.4μm)*(2～7μm)，有明显的凹陷，周生鞭毛，中生芽孢，运动。菌落呈圆形，颜色为乳白色，表面光滑，不透明，不凹起。氧化酶反应呈阴性，明胶反应呈阳性。淀粉水解实验呈阴性，硝酸盐反应呈阳性，VP反应呈阴性，葡萄糖反应呈阳性，柠檬酸反应呈阳性，阿拉伯糖反应呈阴性，木糖反应呈阴性。本专利技术筛选的LK01菌株通过16srDNA基因序列对比分析，与波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)的16srDNA基因序列相似度最高，相似度为83.4％，结合菌体形态特征，生长条件，生理生化特性，确定为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)。波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)LK01能够产生核苷磷酸化酶PyNP。本专利技术分离克隆到核苷磷酸化酶PyNP的编码基因，它具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，全长为1308个核苷酸，编码435个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供了优良的基因材料。本专利技术构建核苷磷酸化酶PyNP基因的表达载体。它可以通过本领域常规方法将本专利技术所述基因连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本专利技术的重组表达载体：将通过PCR扩增所得核苷磷酸化酶PyNP基因片段用限制性内切酶BamHⅠ和NheⅠ进行双酶切，同时将载体pET28a用限制性内切酶BamHⅠ和NheⅠ进行双酶切，然后采用T4DNA连接酶连接，形成含有本专利技术核苷磷酸化酶PyNP基因的重组表达载体pET-PyNP。本专利技术将上述重组表达载体转化至宿主细胞制得重组菌。所述的宿主可为本领域常规的各种宿主，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本专利技术的核苷磷酸化酶PyNP基因能被有效表达即可。本专利技术优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌，即E.coliBL21(DE3)。将前述重组表达载体pET-PyNP转化至E.coliBL21(DE3)，即可得本专利技术优选的重组菌，即E.coliBL21(DE3)/pET-PyNP。本专利技术还提供一种制备重组核苷磷酸化酶的方法，其包括如下步骤：培养本专利技术前述的重组菌，获得重组表达的核苷磷酸化酶PyNP。其中，所述的培养重组菌中所用的培养基可为本领域常规的任何可使转化体生长并产生本专利技术核苷磷酸化酶PyNP的培养基。优选LB培养基，含有蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同，按本领域普通知识进行适当的选择，只要是重组菌能够生长并产生本专利技术所述的核苷磷酸化酶PyNP即可。其他培养重组菌的具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本专利技术涉及的重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-PyNP接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液OD600达到0.6-1.0时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本专利技术的重组核苷磷酸化酶PyNP。本专利技术还提供所述核苷磷酸化酶、重组表达载体或重组菌在合成核苷类似物中的应用。本专利技术提供采用含有所述核苷磷酸化酶基因的重组菌或所述重组菌的培养物或所述核苷磷酸化酶催化合成核苷类似物。优选的技术方案中，催化合成核本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核苷磷酸化酶高产菌株，其分类命名为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)LK01，保藏编号为CCTCC NO: M 2015685。
【技术特征摘要】
1.一种核苷磷酸化酶高产菌株，其分类命名为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)LK01，保藏编号为CCTCCNO:M2015685。
2.一种由权利要求1所述菌株产生的核苷磷酸化酶，其氨基酸序列表如SEQIDNo：2所示。
3.编码权利要求2所述核苷磷酸化酶的基因，所述核苷磷酸化酶基因的序列如SEQIDNO：1所示。
4.含有权利要求3所述基因的重组表达载体或重组菌。
5.权利要求2所述核苷磷酸化酶、权利要求4所述重组表达载体或重组菌在合成核苷类似物方面的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：采用含有权利要求3所述基因的重组菌或所述重组菌的培养物或所述核苷磷酸化酶合成核苷类似物。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，合成核苷类似物反应中，核糖供体为尿苷、2’-脱氧尿苷、胸苷或阿糖尿苷；碱基受体为5-甲基脲嘧啶、胸腺嘧啶、5-氟脲嘧啶、5-氮胞嘧啶或5-氟胞嘧啶；所...
【专利技术属性】
技术研发人员：何冰芳，刘柯，周有治，张劲松，储建林，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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