检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组，所述引物组包含4条引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示，本发明专利技术还建立了针对CSBV的RT-LAMP试剂盒，通过对RT-LAMP条件优化，寻找到了合适的中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT-LAMP检测条件，该试剂盒具有仪器要求简单、操作简便、高敏感度、高特异性、成本低廉、直接观察结果等特点，尤其适合基层技术人员检测使用，对CSBV真正做到早检测，早预防，确保我国中华蜜蜂蜂群的健康发展，保证区域内野生植物和农作物正常授粉，维持生态平衡。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业生物
，具体涉及一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒。
技术介绍
蜜蜂囊状幼虫病是一种严重危害幼虫的病毒性疾病，由蜜蜂囊状幼虫病毒(SacbroodVirus，SBV)引起。蜜蜂囊状幼虫病毒属于小RNA病毒，目前至少可以感染蜜蜂科的两大蜂种即西方蜜蜂和东方蜜蜂，能感染中华蜜蜂的病毒被称为中华蜜蜂囊状幼虫病毒(ChineseSacbroodVirus，CSBV)。此病毒对蜂群危害极其严重，尤其对我国本土蜂种中华蜜蜂危害极其严重；中华蜜蜂为东方蜜蜂一个亚种，对此病毒抵抗力非常弱，极易暴发流行。自从1972年中华蜜蜂囊状幼虫病首次在中国广东爆发至今，此病毒对中华蜜蜂蜂群发展及生产能力造成了严重的影响，导致我国中华蜜蜂的种群数量急剧减少。流行病学调查结果显示，此病目前已成为危害中华蜜蜂种群发展最严重的常发疾病之一。在一些地区，中华蜜蜂囊状幼虫病的发病率高达100％，甚至有些蜂场直接导致蜂群崩溃，当地众多野生植物和农作物的传粉受到了严重的影响，生态环境平衡以及作物收成面临严峻的考验。中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的传播大体可以归纳为群内传播、群间传播、蜂场间传播和地区间传播四个途径。开发有效的病毒早期检测技术，做到早发现、早预防、早控制就显得尤为重要。目前生产实践中主要通过观察症状和聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)方法等检测CSBV，但是当蜂群出现明显症状时通常就错过了最佳防控时期，具有明显滞后性；一般PCR检测条件要求苛刻，且价格昂贵，不利于基层使用和推广。病毒的早期检测技术对于病害的防控意义重大，因此建立快速、准确、简便、经济的CSBV检测方法迫在眉睫。环介导等温平衡扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年日本学者Notomi等开发的一种全新的等温核酸扩增方法，其特征为针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。相对于普通的PCR扩增技术而言具有高特异性、高灵敏性、操作简便、结果判定直观等优点，具体如下：反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下一步即可完成，可在短时间内实现109～1010倍的扩增，只需根据扩增反应产物的有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断。目前针对CSBV的LAMP检测方法仅限于马鸣潇等于2011年证实LAMP可以用于CSBV的检测，实验检测的灵敏度低，效果较差。目前，能够快速、准确、特异、便捷以及经济的检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的RT-LAMP引物组和试剂盒尚未见有报道及应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够快速、灵敏、特异的检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术的专利技术人通过研究中华蜜蜂囊状幼虫病毒的编码基因序列设计了一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组，包含以下四条引物：F3：5’-GGAGGAAAGAATTACGCATTG-3’；B3：5’-TCGAATACTCATTCCAACGAT-3’；FIP：5’-GTAACCATCAGGTGGAAAACTATCTAAAGCAATCAACTTATTGGCC-3’；BIP：5’-CCAGTTAAGCCGACAAATAGCAATATAGATACATTCGCGGGCA-3’。本分专利技术的另一个方面还提供了一种中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法，所述方法包括使用本专利技术所述的RT-LAMP引物组进行RT-LAMP扩增反应。可选的，检测反应条件为：60-65℃下反应55-65min，80℃作用5-10min结束反应。优选的，为了提高检测反应的特异性和灵敏度，检测反应条件为：63℃下反应60min，80℃作用10min结束反应。可选的，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：为了获得更高的灵敏度和特异性检测结果，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：本专利技术所提供的检测方法可以应用于非诊断和治疗目的的中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测。例如应用于中华蜜蜂囊状幼虫病毒研究和应用于与该病毒相关生物制剂的生产领域等。本专利技术的另一个方面提供了一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术所述的RT-LAMP引物组。可选的，在所述试剂盒中还包括RT-LAMP反应所需试剂。在本专利技术的一种优选的实施方式中，所述RT-LAMP反应所需试剂包括链置换DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、甜菜碱、AMV逆转录酶、TritonX-100；上述试剂可以共同组成RT-LAMP反应液，所述RT-LAMP反应液与RT-LAMP引物组共同构成RT-LAMP检测体系。在应用所述试剂盒时，RT-LAMP反应液与RT-LAMP引物组共同构成RT-LAMP检测体系，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：在本专利技术的一种优选的实施方式中，在应用所述试剂盒时，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：可选的，利用所述试剂盒进行检测反应时，检测反应条件为：60-65℃下反应55-65min，80℃作用5-10min结束反应。所述的RT-LAMP引物组或所述的试剂盒在制备检测或诊断中华蜜蜂囊状幼虫病毒的制剂中的用途也属于本专利技术的保护范围。在本专利技术的一种实施方式中可以通过以下所列举的方法进行结果检测，(1)直观检测：显色法：反应结束后加入1μL钙黄绿素，阳性反应结果显示黄绿色，阴性反应保持原黄色不变，在紫外光激发下，阳性样品显示明亮荧光；目视浊度法：将反应结束后获得的反应物离心，阳性反应结果可观察到沉淀，阴性反应无沉淀；荧光实时监测法：反应结束后加入SYBRGreen显色剂，然后置于荧光定量仪实时观察；(2)琼脂糖凝胶电泳：用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，阳性反应呈现特有的梯状条带，阴性反应则无条带出现。本专利技术还提供了所述RT-LAMP引物组在制备检测或诊断中华蜜蜂囊状幼虫病毒的制剂中的用途。与现有的中华囊状幼虫病毒(CSBV)早期检测方法相比，本发明所提供的RT-LAMP试剂盒有显著的优点，具体如下：一、反应迅速，利用AMV逆转录酶实现一步RT-LAMP完成反应，省去了RNA反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT‑LAMP引物组，其特征在于，包含以下四条引物：F3：5’‑GGAGGAAAGAATTACGCATTG‑3’；B3：5’‑TCGAATACTCATTCCAACGAT‑3’；FIP：5’‑GTAACCATCAGGTGGAAAACTATCTAAAGCAATCAACTTATTGGCC‑3’；BIP：5’‑CCAGTTAAGCCGACAAATAGCAATATAGATACATTCGCGGGCA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组，其特
征在于，包含以下四条引物：
F3：5’-GGAGGAAAGAATTACGCATTG-3’；
B3：5’-TCGAATACTCATTCCAACGAT-3’；
FIP：5’-GTAACCATCAGGTGGAAAACTATCTAAAGCAA
TCAACTTATTGGCC-3’；
BIP：5’-CCAGTTAAGCCGACAAATAGCAATATAGATAC
ATTCGCGGGCA-3’。
2.一种中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法，其特征在于，所述方
法包括使用权利要求1所述的RT-LAMP引物组进行RT-LAMP扩增
反应。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘彦杰，黄家兴，孙成，张红，丁桂玲，安建东，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11