本发明专利技术公开一种汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的分离纯化方法及其应用，属于生物工程技术领域，纯化方法包括：1）汉逊酵母细胞的搅拌破碎；2）将步骤1）中得到悬液阴离子交换层析；3）将步骤2）得到层析悬液稀释；4）步骤3)中悬液阳离子交换层析；5）经步骤4）中阳离子交换层析所得组分，浓缩；6）将步骤5）得到的浓缩液使用凝胶过滤柱进行凝胶过滤。采用本发明专利技术所述方法，可以将汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原高效的分离和纯化，适用于规模化生产HBsAg重组蛋白，同时能有效的用于生产乙肝疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的分离纯化方法及其应用，属于生物工程
技术介绍
乙型肝炎(简称乙肝)疫苗已大规模使用愈20年，但乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)感染仍是最为严重的全球性健康问题之一。据世界卫生组织报道，全世界约20亿人有现状或既往乙肝病毒感染标志，每年约有60万人死于HBV感染引起的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌。我国乙肝病毒携带者超过1亿，现有患者超过2000万，南方流行重于北方，农村重于城市。目前并无特异性治疗乙肝的药物，最有效的手段就是接种乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗为血源疫苗，采用无症状带毒者(HBsAg阳性)血浆为原料制备。由于提取方法不同，所得成分也有差别，但均含提纯的22nm小颗粒乙型肝炎表面抗原。80年代以来开始研制第二代乙肝疫苗，系将S基因编码的226个氨基酸产物装配而成的抗原颗粒，采用基因工程方法在哺乳动物细胞和重组酵母中均能表达。重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)乙肝疫苗是最新一代基因工程乙肝疫苗，是继血源疫苗、酿酒酵母疫苗之后的第三代疫苗，系国家863重大科技攻关成果，已有2000万名受种者验证了其安全性。对HBsAg阳性母亲所生新生儿，本市已将母婴阻断率较高的重组(汉逊酵母)乙肝疫苗纳入免疫规划，在出生12小时内给予免费接种；在本地的临床观察中，健康成人全程接种后1个月，97.46％的受种者抗体阳转；全程接种后半年，59.8％的受种者抗体水平在1000mIU/mL以上，因而保护期更长。按照世界卫生组织资料，不同乙肝疫苗的相对效力不以HBsAg含量来判断，10ug重组(汉逊酵母)疫苗适用于任意年龄的易感人群，能提供全面高效持久的免疫保护屏障。免疫预防为主，有效遏制乙肝的高流行状态，基因重组(汉逊酵母)技术为乙型肝炎的免疫预防提供了一种全新的选择。多形汉逊酵母(HansenulaPolymorpha)，又称作Pichiaaugusta，是当前公认的最为理想的外源基因表达系统之一。汉逊酵母也是一种甲醇营养型酵母，与毕赤酵母类似。汉逊酵母中甲醇代谢的主要途径有两种(LodeboerA.M.，etal.，1985)：一种是在过氧化物酶体中进行，甲醇在甲醇氧化酶(methanoloxidase，MOX)作用下生成甲醛和H2O2，甲醛再经甲醛脱氢酶(formaldehydedehydrogenase)和甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase，FMD)作用下生成CO2，H2O2在过氧化氢酶(catalase，CAT)的作用下生成H2O和O2；甲醇的另一个代谢途径发生在过氧化物酶体外，甲醇在细胞质中经过一系列酶的催化作用最后转变为糖类，其中二羟丙酮合成酶(dihydroxyacetonesynthase，DHAS)是这一过程的关键酶。甲醇代谢过程中的各种关键酶，包括MOX、DHAS和CAT等的表达都是在转录水平进行调解的，它们受甲醇、甘油和山梨醇的诱导，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但当葡萄糖浓度低于0.1％时，阻遏作用即被解除。在甲醇完全诱导条件下，过氧化物酶体可占细胞总体积的80％，MOX和DHAS可占细胞总蛋白的15％，它们的启动子具有极强的启动下游基因表达的功能，目前已被用作外源基因在酵母中表达的常用启动子。汉逊酵母作为单细胞真核微生物，既具备原核生物生长快速、易于遗传操作等特点，又有真核细胞翻译后加工和修饰等功能。此外，汉逊酵母还具备安全性好、易于培养、成本低廉、表达量高及遗传稳定等优势，并且能够克服诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株不稳定、产量低及糖基化侧链过长以及毕赤酵母(PichiaPastoris)外源基因整合拷贝数较低的问题。目前，应用汉逊酵母表达系统生产的药物(如胰岛素，商品名Wosulin)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市销售。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术提供一种汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的分离纯化方法及其应用，适用于规模化生产HBsAg重组蛋白。为了实现上述目的，本专利技术采用的一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，包括以下步骤：1)取常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原培养液，通过离心并洗涤用于表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞，然后置于高压匀破碎直至细胞破碎率达到90％，向破碎液中加0.05～1.0％(v/v)的表面活性剂吐温20，调节pH值至8.5，2～8℃下搅拌4～16小时，得悬浮液；2)将步骤1)制备的悬液pH值调节至8.5后，离心除去细胞碎片，调整电导率小于5.0mS/cm，0.45μm或0.2μm微滤，然后进行阴离子交换层析，层析介质为DEAESepheroseFF，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性的流穿；3)将步骤2)得到的悬液使用缓冲液稀释2～4倍，吐温20终浓度0.05～0.9％；4)将步骤3)得到的稀释液进行阳离子交换层析，所述的阳离子交换层析介质的配基为磺丙基或季铵盐，上样结束后，使用含有吐温20终浓度0.05～0.9％的缓冲液再平衡，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性的流穿；5)对经步骤4)中阳离子交换层析所得组分，采用截留分子量为100～500KD的超滤膜将样品一次或多次重复浓缩，直至样品中蛋白质浓度为1.0～2.0mg/ml；6)将步骤5)得到的浓缩液使用凝胶过滤柱进行凝胶过滤，去除部分乙肝表面抗原病毒样颗粒形成的聚集物，最后得到纯度大于99％以上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原。另外，本专利技术还提供一种上述方法分离纯化得到重组乙肝表面抗原在生产乙肝疫苗上的应用。采用本专利技术所述方法，可以将汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原高效的分离和纯化，适用于规模化生产HBsAg重组蛋白，同时能有效的用于生产乙肝疫苗。附图说明图1为甲醇诱导型汉逊酵母高效表达载体pHPZF1.0的构建全过程；图2为乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg高效表达重组载体pHPZF1.0-ZS的构建全过程；图3为SDS-PAGE电泳检测不同重组子HBsAg重组蛋白表达情况：M为标准分子量蛋白(PageRulerTMPlusPrestainedProteinLadderpartNo.2661610～170KDa，ThermoScientific公司产品)；1为阴性对照，pHPZF1.0空载体转化的重组酵母菌株培养120小时破碎液；2～9分别源自pHPZF1.0-ZS转化酵母不同重组子培养120小时破碎液；图4为Western-B本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）取常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原培养液，通过离心并洗涤用于表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞，然后置于高压匀破碎直至细胞破碎率达到90%，向破碎液中加0.05～1.0%（v/v）的表面活性剂吐温20，调节pH值至8.5，2~8℃下搅拌4~16小时，得悬浮液；2）将步骤1）制备的悬液pH值调节至8.5后，离心除去细胞碎片，调整电导率小于5.0mS/cm，0.45μm或0.2μm微滤，然后进行阴离子交换层析，层析介质为DEAE Sepherose FF，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性的流穿；3）将步骤2）得到的悬液使用缓冲液稀释2~4倍，吐温20终浓度0.05~0.9%；4）将步骤3）得到的稀释液进行阳离子交换层析，所述的阳离子交换层析介质的配基为磺丙基或季铵盐，上样结束后，使用含有吐温20终浓度0.05~0.9%的缓冲液再平衡，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性的流穿；5）对经步骤4）中阳离子交换层析所得组分，采用截留分子量为100～500KD的超滤膜将样品一次或多次重复浓缩，直至样品中蛋白质浓度为1.0～2.0mg/ml；6）将步骤5）得到的浓缩液使用凝胶过滤柱进行凝胶过滤，去除部分乙肝表面抗原病毒样颗粒形成的聚集物，最后得到纯度大于99%以上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原。...
【技术特征摘要】
1.一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其特征在于，包括以下步
骤：
1）取常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原培养液，通过离心并
洗涤用于表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞，然后置于高压匀破碎直至细胞破碎率达到
90%，向破碎液中加0.05～1.0%（v/v）的表面活性剂吐温20，调节pH值至8.5，2~8℃下搅拌4~
16小时，得悬浮液；
2）将步骤1）制备的悬液pH值调节至8.5后，离心除去细胞碎片，调整电导率小于5.0mS/
cm，0.45μm或0.2μm微滤，然后进行阴离子交换层析，层析介质为DEAESepheroseFF，收集
含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性的流穿；
3）将步骤2）得到的悬液使用缓冲液稀释2~4倍...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄恩启，吴常伟，李超，王力卫，刘术敏，程英杰，陶立峰，杨世龙，
申请(专利权)人：安徽智飞龙科马生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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