一种基于滚环扩增的DNA定量方法技术

本发明专利技术公开了一种基于滚环扩增的DNA的定量方法。采用不同浓度的DNA标准品溶液经过滚环扩增反应、限制性酶切反应、电泳并对目的条带的亮度进行定量分析得到目的条带的亮度值，从而获得DNA标准品溶液的浓度与目的条带的亮度值之间的标准曲线；然后将待定量DNA溶液对应的目的条带的亮度值代入标准曲线公式，从而完成待定量DNA的定量。本发明专利技术方法其灵敏度与PicoGreen荧光染料定量法接近，而且不需要昂贵的设备，只需要水浴锅、电泳仪和扫胶仪。本发明专利技术的方法可以对pg级别的链状DNA进行定量测试。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术涉及一种DNA的定量方法，具体涉及一种基于滚环扩增的DNA的定量方法。
技术介绍

DNA定量对于生物学研究，食品和医药行业都很重要。很多不同的方法都被用来进行DNA的定量：
最经典和最常用的方法是UV分光光度测定法，该方法的原理是样品在260nm的吸光度与样品中的核酸浓度是相对应的，最新的分光光度计只需要1微升的DNA溶液，而且不需要使用比色皿即可测试。分光光度测定法方便并且使用广泛，但是有一些缺陷：它不能区分双链DNA、单链DNA和游离核苷酸，蛋白、多糖、苯酚以及其它的有机和无机物也会影响260nm处的吸光值，最重要的是，DNA浓度达到5ng/μl（5μg/ml）时灵敏度就会下降，最低测量限度是2ng/μl。
最灵敏的定量方法是数字PCR，其可以发现单个的DNA的分子。数字PCR将样品分散到多个独立的实时定量荧光（real-time）PCR反应中，含有目标分子的反应是阳性的，不含有的就是阴性；经过PCR分析后，不需要标准曲线或内参就可以计算出样品中目标分子的数量。RealtimePCR定量的原理是输入的DNA与指数期的PCR产物是对应的关系；但无论是数字PCR还是RealtimePCR都需要序列特异性的引物或探针，而且需要昂贵的实验设备。
荧光测定法的灵敏度和成本介于分光光度测定法和数字PCR之间。荧光染料可以结合样品中的DNA，在UV的激发下，嵌入DNA的染料可以发射出荧光，从而计算出DNA的浓度。许多DNA染料被用来进行DNA定量，比如溴化乙锭，Picogreen荧光染料。Picogreen能够选择性地结合双链DNA，被广泛使用到双链DNA的定量中，因为没有结合DNA的Picogreen没有荧光，利用picogreen的荧光定量方法灵敏度可以达到0.1pg/ul，需要至少含有20pgDNA的200ul样品来进行测定，因为picogreen对单链DNA的结合力很低，因此RNA，单链DNA和游离核苷酸对测定的影响很小；而且picogreen定量不受盐、乙醇和氯仿等杂质的干扰。但是荧光定量法需要特殊的仪器，比如酶标仪和Qubit，不是所有的实验室都具备这样的条件，这限制了该方法的应用。

技术实现思路

本专利技术的目的是提供一种基于滚环扩增的DNA的定量方法，该方法灵敏度高，不需要昂贵的设备，并且样品需要量少。
本专利技术的总体思路是，采用不同浓度的DNA标准品溶液经过滚环扩增反应、限制性酶切反应、电泳并对目的条带的亮度进行定量分析得到目的条带的亮度值，从而获得DNA标准品溶液的浓度与目的条带的亮度值之间的标准曲线；然后将待定量DNA溶液对应的目的条带的亮度值代入标准曲线公式，从而完成待定量DNA的定量。
为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
一种基于滚环扩增的DNA定量方法，包括以下步骤：
（1）将不同浓度的DNA标准品溶液分别经过滚环扩增反应、限制性酶切反应、电泳分析获得DNA溶液的浓度与目的条带的亮度值之间的对应关系，从而制备出DNA溶液的浓度与电泳目的条带亮度值之间的关系曲线；
（2）将未知浓度的待定量DNA溶液经过滚环扩增反应、限制性酶切反应、电泳分析获得目的条带的亮度，将目的条带的亮度带入步骤（1）的关系曲线中获得待定量DNA溶液的浓度；从而完成待定量DNA的定量；
所述步骤（2）中的滚环扩增反应、限制性酶切反应以及电泳分析所采用的工艺参数以及试剂与步骤（1）一致；
所述步骤（1）与步骤（2）同时平行操作；
所述滚环扩增为：将DNA溶液加入到滚环扩增样品缓冲液中，于90～98℃反应1～5分钟得到混合液，然后将混合液瞬间离心；再加入反应缓冲液，于25～35℃反应1～5小时；最后在60～70℃反应8～15分钟，得到滚环扩增产物；
所述限制性酶切反应为：将上述滚环扩增产物与酶切10xbuffer、水以及限制性内切酶混匀后于35～40℃反应0.5～5小时得到滚环扩增产物的酶切产物；
所述电泳分析为：对上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳测试，并对目的条带的亮度进行定量分析。
上述技术方案中，步骤（1）中，待定量DNA溶液、样品缓冲液以及反应缓冲液的体积比为1∶2∶2；步骤（2）中滚环扩增产物、酶切10xbuffer、水以及限制性内切酶的体积比为10∶6∶21∶3；电泳测试中电泳反应时琼脂糖凝胶的浓度是0.6%，利用ImageJ软件对目的条带的亮度进行定量分析。
优选的技术方案中，滚环扩增中，于95℃反应3分钟得到混合液；加入反应缓冲液后，于30℃反应1～5小时；最后在65℃反应10分钟，得到滚环扩增产物。限制性酶切反应中，于37℃反应1小时得到酶切产物。此反应条件下，采用本专利技术的方法可以获得准确、有效地扩增产物，利于DNA定量的准确性。
不同浓度的DNA标准品溶液是指已知浓度的DNA溶液，其含有的DNA与待定量DNA一致；不同浓度的DNA溶液至少为4种浓度的DNA溶液，可以获得准确的DNA溶液的浓度与目的条带的亮度值之间的关系曲线。
上述DNA定量方法可以称为RCA定量法，其灵敏度可以达到10pg/μL，范围从10pg/μL到242ng/μL；样品需要量少，只需要1-2μL就可以进行测定，并且不需要任何昂贵的仪器；采用上述技术方案对DNA的形状大小没有特别限定，适合1-5kb大小的双链环状DNA，同样可以应用于大多数<10kb的单链环状DNA，而且可应用于线状DNA。
本专利技术中，溶解DNA的溶剂为现有技术，比如双蒸水、Tris-Cl；限制性内切酶为现有技术，本领域技术人员可以根据待定量DNA的种类自行选择；瞬间离心处理为离心处理的一种；本专利技术优选的样品缓冲液包括随机引物、Tris–HCl(400mM,pH8.0)、KCl(160mM)；反应缓冲液包括Tris-HCl(125mM,pH7.5)、MgCl2(25mM)、(NH4)2SO4(25mM)、DTT(10mM)、dNTP(使用终浓度为0.2mM)；酶切10xbuffer为缓冲液，与限制性内切酶配套使用。本专利技术中，未知DNA溶液定量的反应条件，包括工艺参数、添加试剂等都与制备标准曲线的DNA反应一样；为了进一步增加定量结果的准确性，本专利技术限定制备标准曲线时的操作与未知浓度DNA溶液定量时的操作同时平行进行。根据已知不同浓度的DNA标准品溶液经过滚环扩增反应、限制性酶切反应、电泳测试并对目的条带的亮度进行定量分析获得的目的条带的亮度值，得到DNA溶液的浓度与目的条带的亮度值之间的关系，制备标准曲线；根据未知浓度的同种DNA的溶液测得的目的条带的亮度值，结合标准曲线，完成DNA的定量。
与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
（1）本专利技术公开的DNA的定量方法灵敏度高，测试对象的浓度范围广，从10pg/μL到242ng/μL；样品需要量少，只需要1-2μL就可以进行测定；检出限低，可以达到10pg/μL，结果准确，误差低，避免了现有技术中随着待测样品浓度低，灵敏度下降的缺点。
（2）本专利技术公开的方法对DNA的形状大小没有特别限定，适合2-5kb大小的双链环状DNA，同样可以应用于大多数<10kb的双链环状DNA或单链环状DNA，而且可应用于线状DNA；应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于滚环扩增的DNA定量方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将不同浓度的DNA标准品溶液分别经过滚环扩增反应、限制性酶切反应、电泳分析获得DNA溶液的浓度与目的条带的亮度值之间的对应关系，从而制备出DNA溶液的浓度与电泳目的条带亮度值之间的关系曲线；（2）将未知浓度的待定量DNA溶液经过滚环扩增反应、限制性酶切反应、电泳分析获得目的条带的亮度，将目的条带的亮度带入步骤（1）的关系曲线中获得待定量DNA溶液的浓度；从而完成待定量DNA的定量；所述步骤（2）中的滚环扩增反应、限制性酶切反应以及电泳分析所采用的工艺参数以及试剂与步骤（1）一致；所述步骤（1）与步骤（2）同时平行操作；所述滚环扩增为：将DNA溶液加入到滚环扩增样品缓冲液中，于90～98℃反应1～5分钟得到混合液，然后将混合液瞬间离心；再加入反应缓冲液，于25～35℃反应1～5小时；最后在60～70℃反应8～15分钟，得到滚环扩增产物；所述限制性酶切反应为：将上述滚环扩增产物与酶切10xbuffer、水以及限制性内切酶混匀后于35～40℃反应0.5～5小时得到滚环扩增产物的酶切产物；所述电泳分析为：对上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳测试，并对目的条带的亮度进行定量分析。...

【技术特征摘要】
1.一种基于滚环扩增的DNA定量方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将不同浓度的DNA标准品溶液分别经过滚环扩增反应、限制性酶切反应、电泳分析获得DNA溶液的浓度与目的条带的亮度值之间的对应关系，从而制备出DNA溶液的浓度与电泳目的条带亮度值之间的关系曲线；
（2）将未知浓度的待定量DNA溶液经过滚环扩增反应、限制性酶切反应、电泳分析获得目的条带的亮度，将目的条带的亮度带入步骤（1）的关系曲线中获得待定量DNA溶液的浓度；从而完成待定量DNA的定量；
所述步骤（2）中的滚环扩增反应、限制性酶切反应以及电泳分析所采用的工艺参数以及试剂与步骤（1）一致；
所述步骤（1）与步骤（2）同时平行操作；
所述滚环扩增为：将DNA溶液加入到滚环扩增样品缓冲液中，于90～98℃反应1～5分钟得到混合液，然后将混合液瞬间离心；再加入反应缓冲液，于25～35℃反应1～5小时；最后在60～70℃反应8～15分钟，得到滚环扩增产物；
所述限制性酶切反应为：将上述滚环扩增产物与酶切10xbuffer、水以及限制性内切酶混匀后于35～40℃反应0.5～5小时得到滚环扩增产物的酶切产物；
所述电泳分析为：对上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳测试，并对目的条带的亮度进行定量分析。
2.根据权利要求1所述基于滚环扩增的DNA定量方法，其特征在于：待定量DNA溶液、样品缓冲液以及反应缓冲液的体积比为1∶2∶2。
3...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪媛媛，李世红，孙中平，陈维之，
申请(专利权)人：苏州金唯智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32