本发明专利技术涉及一种鉴定鲁棉研29号品种纯度的SSR分子标记引物组及其应用，该引物组由5对引物组成，分别为：分子标记CIR246的引物，分子标记NAU3995的引物，分子标记NAU6960的引物，分子标记DPL0528的引物，分子标记NAU4926的引物。本发明专利技术通过筛选鲁棉研29号的特征SSR引物，通过比对筛选出5对引物，构成SSR分子标记引物组，该引物组可用于快速检测鲁棉研29号品种的种子纯度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鉴定鲁棉研29号品种纯度的SSR分子标记引物组及其应用，利用鲁棉研29号的特异引物组对鲁棉研29号供检样品进行品种纯度鉴定，属于生物技术
技术介绍
棉花是我国重要的经济作物，在我国国民经济与社会发展中具有重要地位。种子质量关系到农业生产安全，而种子纯度是衡量种子质量的重要指标之一。种子在良种繁育过程中往往会出现机械混杂，生物学混杂等现象，导致种子遗传纯度下降，同时，在销售环节中一些不法分子或种子经营单位为追求高额利润以劣充好，人为掺假等，导致优良品种纯度受到严重影响，进而影响优良品种的市场销售信誉及其产业化发展。因此，为有效监控优良品种的生产质量，规范优良品种的销售市场，建立一套快速、准确(简便、经济)鉴定品种纯度的方法是棉花生产经营过程中最为迫切解决的问题之一。
目前我国棉种的品种纯度鉴定主要依靠田间小区种植形态鉴定方法，鉴定所需时间长，成本高，并受季节的限制，而且作物的表现型易随环境条件的变化而变化，特别是鉴定一些形态差异较小的品种难度更大。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，以DNA为基础的分子标记技术可有效鉴定品种在分子水平上的遗传差异，与其它分子标记相比，SSR(SimpleSequenceRepeat，简单序列重复)分子标记技术具有独特的优越性：SSR分子标记呈共显性，标记数量丰富，多态性高，遗传稳定，不受环境条件影响。
目前SSR标记已广泛应用于遗传连锁图谱的构建、遗传多样性研究和品种资源鉴定等方面。在纯度鉴定方面，SSR分子标记已成功应用于多种作物杂交品种的纯度鉴定，目前还未见作物常规品种纯度鉴定的分子检测方法，因此有必要依据SSR标记引物研发一种经济简便实用的纯度鉴定方法，以提高棉花常规品种纯度检测的效率。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种鉴定鲁棉研29号品种纯度的SSR分子标记引物组及其应用。利用该引物组可以解决现有品种纯度检测工作存在的问题。
本专利技术技术方案如下：
一种鉴定鲁棉研29号品种纯度的SSR分子标记引物组，该引物组由5对引物组成，分别为：
分子标记CIR246的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
分子标记NAU3995的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
分子标记NAU6960的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
分子标记DPL0528的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；
分子标记NAU4926的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；
上述SSR分子标记引物组在鉴定鲁棉研29号品种纯度中的应用。
上述应用，步骤如下：
(1)将待检测棉花干种子室温条件下浸泡后，去除种皮，浸入裂解缓冲液中，破碎后，在60～70℃水浴15～25min，离心，取上清，然后加入预冷的异丙醇，离心，取沉淀，经洗涤、晾干，加双蒸水溶解后，离心，取上清，制得DNA提取样品；
(2)以步骤(1)制得的DNA提取样品为模板，分别以SSR分子标记引物组中的5对引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)分别对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行电泳检测，经染色后，将染色结果的带型与鲁棉研29号纯品的染色结果的带型进行对比，带型与鲁棉研29号纯品全部相同的为纯品，任意一个以上检测位点带型不同的为杂种子，种子纯度按如下方法计算：
种子纯度＝检测到的与鲁棉研29号纯品的带型相同的个数/检测种子总数×100％。
根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中的浸泡时间为18～24小时；离心条件为：4℃、12000r/min离心8min；所述洗涤为采用体积百分比为70％的乙醇溶液洗涤；所述预冷的异丙醇加入量为0.7倍体积。
根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中的裂解缓冲液中含有如下成分：
2wt％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，0.02mol/LEDTA(四乙酸二氨基乙烷)，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl，2wt％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，1wt％β-巯基乙醇。
根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下(10μL)：
10×PCRBuffer1μL，10mMdNTPMix0.2μL，10μmol/L的正向引物0.6μL、10μmol/L的反向引物0.6μL，5UTaqDNA聚合酶0.1μL，20～200ng/μL的待测样品DNA2μL，ddH2O5.6μL。
根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR反应程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，循环32次；72℃延伸5min。
根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，所述电泳为采用8wt％非变性聚丙烯酰胺电泳。
根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，染色步骤如下：
用0.1wt％的AgNO3溶液染色10min，再用含2wt％NaOH和0.4wt％甲醛的水溶液显影至带型清晰。
有益效果
1、本专利技术通过筛选鲁棉研29号的特征SSR引物，通过比对筛选出5对引物，构成SSR分子标记引物组，该引物组可用于快速检测鲁棉研29号品种的种子纯度；
2、本专利技术通过采用了适用于上述引物组的检测方法，通过对DNA提取方法等步骤进行改进，获得了效果好、检测速度快、检测结果准确、经济简便、稳定可靠、不受环境条件及发育时期影响的优点，适用于快速检测鲁棉研29号品种的种子纯度；
3、本专利技术直接采用种子提取DNA，省略了苯酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质步骤，不使用有毒试剂，有利于大规模快速提取DNA。
4、本专利技术简化了染色步骤，大大提高了电泳检测效率。
附图说明
图1为采用本专利技术分子标记CIR246的引物检测常规棉品种鲁棉研29号种子的SSR-PCR纯度检测电泳图；
图2为采用本专利技术分子标记NAU3995的引物检测常规棉品种鲁棉研29号种子的SSR-PCR纯度检测电泳图；
图3为采用本专利技术分子标记NAU6960的引物检测常规棉品种鲁棉研29号种子的SSR-PCR纯度检测电泳图；
图4为采用本专利技术分子标记DPL0528的引物检测常规棉品种鲁棉研29号种子的SSR-PCR纯度检测电泳图；
图5为采用本专利技术分子标记NAU4926的引物检测常规棉品种鲁棉研29号种子的SSR-PCR纯度检测电泳图；
图1-5中：M为分子量标准，1为鲁棉研29号标准样，2-21号是鲁棉研29号商品样品种子。
图6为采用本专利技术分子标记CIR246的引物检测混杂了其它品种的常规棉品种鲁棉研29号种子的SSR-PCR纯度检测电泳图；
图7为采用本专利技术分子标记NAU3995的引物检测混杂了其它品种的常规棉品种鲁棉研29号种子的SSR-PCR纯度检测电泳图；
图8为采用本专利技术分子标记NAU6960的引物检测混杂了其它品种的常规棉品种鲁棉研29号种子的SSR-PCR纯度检测电泳图；
图9为采用本专利技术分子标记D本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定鲁棉研29号品种纯度的SSR分子标记引物组，该引物组由5对引物组成，分别为：分子标记CIR246的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记NAU3995的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；分子标记NAU6960的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；分子标记DPL0528的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；分子标记NAU4926的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
【技术特征摘要】
1.一种鉴定鲁棉研29号品种纯度的SSR分子标记引物组，该引物组由5对引物组成，
分别为：
分子标记CIR246的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸
序列如SEQIDNO.2所示；
分子标记NAU3995的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物核苷
酸序列如SEQIDNO.4所示；
分子标记NAU6960的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物核苷
酸序列如SEQIDNO.6所示；
分子标记DPL0528的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，下游引物核苷
酸序列如SEQIDNO.8所示；
分子标记NAU4926的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，下游引物核苷
酸序列如SEQIDNO.10所示。
2.权利要求1所述SSR分子标记引物组在鉴定鲁棉研29号品种纯度中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)将待检测棉花干种子室温条件下浸泡后，去除种皮，浸入裂解缓冲液中，破碎后，
在60～70℃水浴15～25min，离心，取上清，然后加入预冷的异丙醇，离心，取沉淀，经
洗涤、晾干，加双蒸水溶解后，离心，取上清，制得DNA提取样品；
(2)以步骤(1)制得的DNA提取样品为模板，分别以SSR分子标记引物组中的5对
引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)分别对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行电泳检测，经染色后，将染色结果的带
型与鲁棉研29号纯品的染色结果的带型进行对比，带型与鲁棉研29号纯品全部相同的为纯
品，任意一个以上检测位点带型不同的为杂种子，种子纯度按如下方法计算：
种子纯度＝检测到...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘国栋，王芙蓉，张军，张传云，张景霞，陈煜，周娟，
申请(专利权)人：山东棉花研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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