本发明专利技术涉及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本发明专利技术涉及白喉毒素无毒突变体CRM197或其片段在融合蛋白中作为分子内佐剂增强与其融合的目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的用途。本发明专利技术还涉及增强目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的方法，其包括将CRM197或其片段与目的蛋白融合表达，形成融合蛋白。本发明专利技术还涉及包含CRM197或其片段以及目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的融合蛋白，其中CRM197或其片段增强了目的蛋白的免疫原性。本发明专利技术还涉及编码所述融合蛋白的分离的核酸，包含所述核酸的构建体和载体，以及包含所述核酸的宿主细胞。本发明专利技术还涉及所述融合蛋白的用途，其用于制备药物组合物或疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本专利技术设及白喉毒素无毒突变 体CRM197或其片段在融合蛋白中作为分子内佐剂增强与其融合的目的蛋白（例如皿V衣壳 蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的用途。本专利技术还设及增强目的蛋白 (例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段）的免疫原性的方法，其包括将 CRM197或其片段与目的蛋白融合表达，形成融合蛋白。本专利技术还设及包含CRM197或其片段 W及目的蛋白（例如皿V衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段）的融合蛋白，其中 CRM197或其片段增强了目的蛋白的免疫原性。本专利技术还设及编码所述融合蛋白的分离的核 酸，包含所述核酸的构建体和载体，W及包含所述核酸的宿主细胞。本专利技术还设及所述融合 蛋白的用途，其用于制备药物组合物或疫苗。
技术介绍
已对白喉毒素 (diphtheria toxin,DT)进行了深入的研究。结构研究显示，白喉毒 素由S个结构域组成:N端的催化结构域C(aa 1-190，C domain)(其也称为A片段），中间转 膜结构域了（日日201-384，了（1〇111日111)，^及(：端的受体结合位点结构域1?(日日386-535，1? domain)(化oe S,Bennett M,Fujii G,et al.，化ture.1992.357:216~222)。利用白喉毒 素的前两个结构域与白介素2(化-2)融合而制备的0NTAK(DAB389-化-2)在1999年被美国 FDA批准上市，用于成人皮肤T细胞淋己瘤的治疗。运证实白喉毒素的S个结构域可W进行 拆分并发挥其各自的功能。 CRM197(Cross-Reacting Materials 197)是白喉毒素的一种无毒突变体 (Uchida，T.，A.M,Pappenheimer,Jr.，R.Gregory，et al.,J.Biol.Qiem.1973.248:3838-3844)，其与编码DT的野生型基因相比存在单个核巧酸突变，导致第52位的氨基酸残基由 G 1 y 变为G1 U ( G . G i ann i n i，R . Rappuo 1 i，G . Ra 11 i e t al . ,Nucleic Acids Research.1984.12:4063-4070)〇 研究表明，CRM197虽然具有与野生型DT类似的结构（即，具有上述3个结构域），但 其A片段丧失了与MD结合的能力，不能结合EF2并因而丧失了天然DT所具有的细胞毒性，运 表明第52位氨基酸残基Gly在DT与NAD的结合中起着重要作用化.Moyner，G.化ristiansen， Acta path microbial immunolscand sect C. 1984,92:17-23) 〇CRM197虽然丧失了细胞毒 性，但其却保留了与野生型DT相当的、极强的免疫原性，因此其常被用作蛋白载体，用于与 其他半抗原交联从而制备结合疫苗。 早在1985年，Porter等人就将化b表面的多糖分别交联至CRMl 97和DT蛋白载体并 制成疫苗，并且研究两者的免疫原性的差异。实验结果表明，两种交联疫苗的免疫效果没有 显著差异，二者都能刺激幼儿机体产生较强的免疫反应和免疫记忆(Porter Anderson, Micheal E.Pichichero and !Richard A.J.Clin.Invest.1985:52-59)。在比较与各种蛋白 载体交联的肺炎球菌结合疫苗后发现，WCRM197为蛋白载体的疫苗在动物实验和临床试验 中均能产生较好的免疫效果，且CRM197安全，无毒负作用（Black，S.，H.化inefield，et al.Pediatr Infect Dis J，2000，19(3);187-195)。目前WCRM197为蛋白载体的肺炎球菌 结合疫苗主要有:PCV7、PCV9，PCV13等。临床试验结果证明，运些疫苗在2岁W下的儿童中均 具有较好的免疫原性和安全性（Barricai^te,A.,J.Castilla,et al.Clin Infect Dis, 2007，44(11):1436-1441;Madhi，S.，P.Adrian，et al.化ccine，2007，25(13):2451-2457; Duggan，S.T. Drug S ,2010,70 ( 15) :1973-1986)。将CRM197 与脑膜炎奈瑟氏菌 (N.menigitidis)表面多糖交联可制备流行性脑膜炎的结合疫苗。例如，WCRM197为蛋白载 体的Meningitec(Wyeth Pharmaceuticals)、Menjugate(Novartis vaccines)、Menveo (Novartis vaccines)等疫苗已经上市。 CRM197虽然失去酶活性和细胞毒性，但仍可与DT的特异受体HB-EGF ^eparin-binding EGF-I化e growth factor,肝素结合性表皮生长因子)结合。因为运种受体一般在 癌变组织中表达上调，所WCRM197与DT-样具有抗肿瘤效应（Buzzi，S.，D. RulDboli，et al. Immunotherapy, 2004,53( 11))。研究还发现，CRMl97能透过血脑屏障（Blood-Brain-Barrier BBB)，从而可W用作脑部药物投递的载体(Gaillard,P.J.,and A.G.de Boer.J Control Release,2006,116(2):60-62)〇 虽然已报道CRM197具有多种功能，尤其是具有较强的免疫原性而可用作免疫佐 剂，但是迄今为止从未报道过，CRM197可W用作分子内佐剂在融合蛋白中增强与其融合的 目标蛋白的免疫原性。本专利技术W戊型肝炎衣壳蛋白为例，首次证实了CRM197或其片段在融 合蛋白中能够增强与其融合的蛋白的免疫原性，从而可用作分子内佐剂。
技术实现思路
在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、生物化学、 免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发 明，下面提供相关术语的定义和解释。 根据本专利技术，术语乂 RM197"是指白喉毒素的一种无毒突变体，其与野生型白喉毒 素相比，差异在于第52位的氨基酸残基由Gly变为Glu(G.Giannini，R.Ra卵Uoli，G.Ratti et al. ,Nucleic Acids Research. 1984.12:4063-4070)。白喉毒素是本领域技术人员熟知 的（参见例如，Qioe S,Bennett MiF'ujii G,et al.，Na1:ure. 1992.357:216-222)，其氨基酸 序列可见于例如GenBank登录号AAV70486.1。在本专利技术中，CRM197的示例性氨基酸序列提供于SEQ ID N0:2中。因此，在本专利技术 中，当设及CRM197的序列时，其使用SEQ ID NO: 2所示的序列来进行描述。例如，表述 乂R本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其包含CRM197或其片段以及目的蛋白，并且其中CRM197或其片段增强了目的蛋白的免疫原性，其中，例如，CRM197的片段可以包含，CRM197的A片段，转膜结构域T，和/或受体结合位点结构域R；例如，CRM197片段可以包含A片段，或者A片段和转膜结构域T；例如，CRM197片段可以包含CRM197的aa 1‑190，例如包含CRM197的aa 1‑389；例如，目的蛋白可以是HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段；例如，HEV衣壳蛋白的免疫原性片段可以包含或者是HEV‑239(HEV衣壳蛋白aa 368‑606)，E2(HEV衣壳蛋白aa 394‑606)或E2s(HEV衣壳蛋白aa 455‑606)；例如，目的蛋白可以是流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段；例如，M2蛋白的免疫原性片段可以包含或者是M2e(M2蛋白aa1‑24)；例如，在所述融合蛋白中，CRM197或其片段可连接至目的蛋白的N端和/或C端，任选地使用接头进行连接；例如，所述融合蛋白可以包含CRM197或其片段以及HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段，二者任选地使用接头进行连接；例如，所述融合蛋白可以是具有SEQ ID NO:4，6，8，10，12，14，16或18所示氨基酸序列的蛋白；例如，所述融合蛋白可以包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任选地使用接头进行连接；例如，所述融合蛋白可以是具有SEQ ID NO:34，36，38，40，42或44所示氨基酸序列的蛋白。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：李少伟，宋翠灵，杨春燕，顾颖，罗文新，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门万泰沧海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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