水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法及用该方法制备的疫苗技术

本发明专利技术涉及兽用生物制品领域，具体而言，涉及一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，包括：将制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养；待所述敏感细胞培养至50％以上长成致密单层后向所述生物反应器中接种犬瘟热病毒进行增殖培养；收获病毒培养液及微载体，冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液，将所述病毒液配制后得到疫苗。通过完善各步骤的反应条件，优化生产流程，本发明专利技术达到了生产周期短、病毒滴度高、产品质量稳定、生产效率提高、副反应小的技术效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽用生物制品领域，具体而言，涉及一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法及用该方法制备的疫苗。
技术介绍
水貂犬瘟热也叫貂瘟热，是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)的犬瘟热病毒(Caninedistempervirus，CDV)引起的急性、热性、传染性极强的高度接触性传染病，是水貂养殖业的主要传染病之一。国际上反应器悬浮培养技术已广泛用于生物制药生产，且在高表达细胞株的构建、个性化培养基的研发等方面不断发展，大量新建反应器和产物表达量的提高已导致反应器容量过剩，发达国家市场出现饱和向发展中国家扩展的趋势。在国内，细胞悬浮技术虽然起步较晚，但经过几十年来的研究与实践，目前动物细胞大规模培养技术已有了飞速发展。随着这一技术的进一步发展，使用生物反应器进行细胞高密度培养生产兽用疫苗是该行业发展的必然趋势。伴随着生产工艺的进一步完善及生物反应器设计的更为合理，悬浮细胞培养将会变得越来越容易，不断成熟的大规模动物细胞培养技术也将更有力地推动兽用疫苗规模化生产的发展。目前，国外已有使用微载体在生物反应器中悬浮培养敏感细胞生产部分病毒性疫苗的记载，如赛诺菲巴斯德的脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗，百特的流感疫苗等。国内辽宁成大生物股份有限公司从国外引进了生物反应器高密度培养敏感细胞生产疫苗的技术，已用于大规模制备人用狂犬病疫苗，南京梅里亚使用微载体在生物反应器中培养敏感细胞生产鸡传染性法氏囊疫苗，均取得了良好的社会效益和经济效益。但目前关于使用微载体在生物反应器中培养敏感细胞生产犬瘟热疫苗方面仍是空白。现有的水貂犬瘟热疫苗都是通过传统的转瓶培养工艺生产。传统转瓶工艺存在诸多缺点如：自动化程度低、劳动强度大；培养细胞的环境不可控，容易被环境污染；耗时长、效率低、生产成本高，难以扩大生产；不同批次间质量差异大；涉及生物安全和公共卫生问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种悬浮培养敏感细胞生产水貂犬瘟热病毒活疫苗的方法，所述的方法与传统水貂犬瘟热病毒活疫苗生产工艺相比，生产周期短、病毒滴度高，使用该方法生产的产品质量稳定、生产效率提高、副反应小。一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，包括如下步骤：1)将制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养；2)、待所述敏感细胞培养至50％以上长成致密单层后向所述生物反应器中接种犬瘟热病毒进行增殖培养；3)、收获病毒培养液及微载体，冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液，将所述病毒液配制后得到疫苗。细胞微载体悬浮培养更容易更换培养液，且提供了更大的供细胞贴壁生长的表面积，因而使得细胞达到更高的培养密度；本申请所用的生物反应器具体为搅拌反应器(微载体培养用)，配合微载体悬浮培养技术，可达到占地空间少、细胞产量高(进而病毒滴度高)、生产成本低的技术效果。在本领域中，应用悬浮培养法生产水貂犬瘟热病毒活疫苗尚属首次，本专利技术通过完善各步骤的反应条件，优化生产流程，达到了生产周期短、产品质量稳定、生产效率提高、副反应小的技术效果。优选的，如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法：所述制苗用敏感细胞为Vero、MDCK、Marc-145；所述犬瘟热病毒的毒株为CDV3-CL株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCCNO.10768。CDV3-CL株保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为：2015年06月10日。优选的，如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，在步骤1)中：所接种的制苗用敏感细胞的细胞密度为4×105～2×106个/mL；用于培养的微载体为Cytodex微载体，其使用密度为3～10g/L。微载体培养(microcarrierculture)是一种用于高产量培养贴壁细胞的实用技术。Cytodex专用于培养各类动物细胞，其培养体积可以从数毫升到6000升以上。应用Cytodex微载体技术，可以实现简单的贴壁细胞悬浮化培养，每毫升培养液可得到数百万细胞。微载体适于摇瓶、转瓶、搅拌罐以及WAVE生物反应器等各种培养系统。本专利技术所用微载体具体可为Cytodex-1、2、3，优选为Cytodex-1，购自GE(通用电气)公司。进一步优选的，如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，在步骤1)中：在培养所述制苗用敏感细胞时所用的细胞培养液为：含5％～8％的新生牛血清的DMEM培养液；用微载体培养时的培养条件为：温度36～38℃、CO2含量4.8～5.2％、搅拌速度为55～65rpm、溶氧为45～55％、pH7.2～7.4、反应器自动控制培养。优选的，如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，在步骤1)中，在生物反应器中培养所述敏感细胞时包括单级培养或放大培养；所述单级培养为5～14L生物反应器单级培养模式；所述放大培养为40～140L放大培养模式；放大培养的操作为将单级培养后的微载体上生长的细胞作为初始细胞在密闭容器中用胰酶消化，通过90～120μm的滤网过滤，将细胞悬液接入下一级更大的生物反应器中继续培养，将培育得到细胞作为下一次放大培养操作的初始细胞并重复上述放大培养的操作，逐次放大到40～140L的生产规模。本专利技术消化放大模式采用了自制的消化装置(即所述密闭容器)消化细胞，避免了大规模生产时消化细胞工艺的繁琐操作，且细胞不易受到污染。使用90～120μm的不锈钢网过滤将消化细胞与原培养载体分离，避免了在培养过程中细胞在新旧球贴附不均的现象。所述自制的消化装置可以放入水浴中加热，容器主体部顶端含有三通孔，其中一端连有装有37℃预热的浓度为0.25％胰酶-0.02％EDTA的胰酶消化液，另一端连接排液瓶。进一步优选的，如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，步骤2)中的操作具体包括：待所述敏感细胞培养20～48h后，接种犬瘟热病毒进行增殖培养，接种量为0.001～0.01MOI；或，待所述敏感细胞培养48～72h后，停止搅拌，待微载体沉淀到罐底后排出所有细胞培养液；加入细胞维持液并接种犬瘟热病毒进行增殖培养，接种量为0.001～0.01MOI。更优选的，当细胞培养20～48h后，细胞密度为1×106～3×106个/mL时即可接种犬瘟热病毒。优选的，如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养；2)、待所述敏感细胞培养至50％以上长成致密单层后向所述生物反应器中接种犬瘟热病毒进行增殖培养；3)、收获病毒培养液及微载体，冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液，将所述病毒液配制后得到疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，其特征在于，包括如下步
骤：
1)将制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养；
2)、待所述敏感细胞培养至50％以上长成致密单层后向所述生物反应
器中接种犬瘟热病毒进行增殖培养；
3)、收获病毒培养液及微载体，冻融后去除微载体及细胞碎片得到病
毒液，将所述病毒液配制后得到疫苗。
2.根据权利要求1所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，其特征
在于：
所述制苗用敏感细胞为Vero、MDCK、Marc-145；
所述犬瘟热病毒的毒株为CDV3-CL株，保藏于中国微生物菌种保藏管
理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCCNO.10768。
3.根据权利要求2所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，其特征
在于，在步骤1)中：
所接种的制苗用敏感细胞的细胞密度为4×105～2×106个/mL；
用于培养的微载体为Cytodex微载体，其使用密度为3～10g/L。
4.根据权利要求3所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，其特征
在于，在步骤1)中：
在培养所述制苗用敏感细胞时所用的细胞培养液为：含5％～8％的新
生牛血清的DMEM培养液；
用微载体培养时的培养条件为：温度36～38℃、CO2含量4.8～5.2％、搅
拌速度为55～65rpm、溶氧为45～55％、pH7.2～7.4、反应器自动控制培养。
5.根据权利要求3所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法，其特征
在于，在步骤1)中，在生物反应器中培养所述敏感细胞时包括单级培养或
放大培养；
所述单级培养为5～14L生物反应器单级培养模式；
所述放大培养为40～140L放大培养模式；放大培养的操作为：

【专利技术属性】
技术研发人员：尹茉莉，冯二凯，任飞，程世鹏，陈立志，彭风华，盛程程，王萃瑜，王振军，李云松，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，吉林特研生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22