核酸向细胞的胞外体转移制造技术

本发明专利技术涉及一种通过胞外体将核酸引入细胞的方法，该方法用于如基因沉默的基因调控与治疗，并且将遗传物质引入细胞以补偿异常基因、或诱导或抑制在受体细胞中的进程。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种通过胞外体将核酸引入细胞的方法，该方法用于如基因沉默的基因调控与治疗，并且将遗传物质引入细胞以补偿异常基因、或诱导或抑制在受体细胞中的进程。【专利说明】核酸向细胞的胞外体转移本申请是申请日为2007年5月2日、专利技术名称为"核酸向细胞的胞外体转移"的中国 专利申请No ? 200780015469 ? 0的分案申请。 相关申请的交叉参考 本申请要求于2006年5月3日提交的第60/797,149号美国临时申请的优先权，在此 引入作为参考。 专利技术背景 专利
本专利技术是基于释放到细胞外环境的胞外体能从亲本细胞携带选择性RNA的意外发 现。根据本专利技术，该发现可以用于通过胞外体向受体细胞转移遗传物质。通过向受体细胞转 移核酸，胞外体会影响其它细胞(受体细胞)的蛋白质机能，并因此影响蛋白质内含物。本发 明首次证明利用胞外体能够将核酸，如RNA、DNA在细胞或器官之间有意地转移，从而可以用 于哺乳动物细胞的基因调控和治疗。 相关技术描述 胞外体是由多泡体与质膜融合后释放到细胞外环境中的内吞源性的小膜囊泡。胞 外体的直径大小在30和100nm之间。其表面由来自供体细胞细胞膜的脂双层构成，而且其含 有来自产生该胞外体的细胞的胞浆，并且从表面的亲本细胞表达膜蛋白。 胞外体根据其衍生细胞的细胞类型而表现不同的组成和功能。不存在"胞外体特 异性"蛋白；然而在这些囊泡内鉴定出的几种蛋白质与反映其来源的内含体和溶酶体有关。 多数胞外体富含MHC I和MHC II (主要组织相容性复合体I和II;其对于将抗原提呈给如T-淋巴细胞等免疫活性细胞很重要）、四跨膜蛋白（tetraspanins)、几种热休克蛋白、细胞骨 架成分(如肌动蛋白和微管蛋白）、细胞膜融合相关蛋白、信号转导蛋白和胞浆酶。 胞外体由多种细胞产生，包括上皮细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)及 树突细胞(DC)。在人类中，胞外体已经在血浆、尿、支气管肺泡灌洗液、肠上皮细胞和肿瘤组 织中发现。 胞外体的所有功能并未全部阐明，但数据强烈显示了它们介导细胞间通讯。这种 通讯能以不同方式发生。首先，胞外体能以细胞与细胞间相互作用相似的方式结合到细胞 表面受体。其次，胞外体能粘附至细胞膜上并为细胞提供新的受体和特性。因此，胞外体也 能与靶细胞融合并在两种细胞类型间交换膜蛋白和胞浆。 我们对了解特定的由肥大细胞释放的胞外体的内含物及生物学功能方面做了特 别的努力。在蛋白质组分析中，我们发现这些胞外体含有比先前所了解的更多的蛋白质。然 而，我们研究中的独特发现是我们发现源自肥大细胞的胞外体中含有大量选择性RNA。此 外，不同的受体细胞的使用表现出胞外体RNA的吸收，这表明了遗传物质从胞外体向受体细 胞内的转移，这种转移将依次导致靶细胞内特定蛋白质的翻译。 考虑到胞外体蛋白内含物及其与不同受体细胞通讯的能力，尤为有用的是能够修 改胞外体的基因内含物，以便添加或调节受体细胞的基因。本申请描述了利用胞外体携带 特定遗传物质和将其转移到受体细胞的能力的方法。在该方法中，受体的功能及其保持存 活、进一步发育、增殖或成熟的能力受到影响。 该方法独特，且不同于任何先前所描述的方法。一些专利和专利申请经由胞外体 蛋白与免疫细胞之间的相互作用，通过其刺激或抑制功能利用胞外体来影响免疫系统，并 通过影响免疫系统来治疗病毒性疾病。已经表明胞外体蛋白质能通过突变来修饰以影响免 疫系统。然而，我们尚未发现任何专利或专利申请或任何公开可用的信息描述或表明了胞 外体向细胞转移遗传物质或核酸的用途。 专利技术概述 本专利技术公开了通过胞外体向受体细胞递送核酸构建体的新方法。本专利技术的方法包 括利用亲本细胞将RNA和DNA构建体转移到胞外体内（亲本细胞的转化、转染、或修饰），或使 用如转化和转染等传统方法，直接将核酸引入胞外体。本专利技术的方法是一种非常好的基因 治疗手段，该手段通过向受体细胞引入遗传物质来补偿异常基因或引入产生蛋白质的RNA 或DNA，该蛋白质影响受体细胞功能或存活能力或发育能力或成熟能力。对于基因治疗来 说，通常使用病毒或脂质体作为载体来转移遗传物质，这是由于它们能通过感染细胞来递 送新的基因。与传统方法相比，使用胞外体有很多优势，最重要地是，胞外体源自细胞，甚至 可能是受体本身的细胞，因此对于免疫系统来说不是外来个体，从而能避免不利的免疫反 应。因此对于用于基因调控和治疗来说，胞外体容易产生、分离和修饰。 通过以下内容和随附的权利要求书，本专利技术的其它目的和特征将更加明显。专利技术详细说明及其优选实施方式正如本专利技术所述，利用胞外体囊泡向细胞的胞质或核转移遗传物质、核酸能治疗 遗传疾病、细胞或身体功能障碍、诱导或抑制细胞死亡(细胞凋亡）、改变细胞老化、诱导耐 受、重新导向现有的免疫应答、改变胞内活性或细胞行为。它还能用于遗传病症、恶性肿瘤 疾病或涉及如下细胞的疾病的各种基因治疗:免疫细胞或身体内的任何其它细胞类型，包 括脉管组织、上皮细胞、间质细胞、肌肉组织、骨骼系统、神经系统、肝细胞、肾细胞、肠细胞、 肺细胞、皮肤细胞或身体内的任何其它细胞。 本专利技术中描述的能通过胞外体转移的遗传物质是:micr〇RNA、mRNA、tRNA、rRNA、 siRNA、调节RNA、非编码和编码RNA、DNA片段、和DNA质粒，包括各类核酸。将遗传物质(DNA或 RNA的构建体、或各类核酸)直接转移至胞外体的方法是转化、转染和显微注射。 遗传性不同的胞外体可以利用其供体细胞或者通过向其中引入特定核酸进行分 离，以用于进一步向受体细胞递送。产生含有一组遗传物质的不同方法描述如下。 利用胞外体产生细胞来产生遗传性不同的胞外体以用于进一步向受体细胞递送 的不同过程包括： (a)来自不同供体细胞的胞外体含有不同组遗传物质的胞外体可以从不同的供体细胞分离(如B淋巴细胞和T淋巴 细胞、肥大细胞和树突细胞）以用于进一步向受体细胞递送。由于供体细胞的作用和环境不 同而引起其基因型不同，因此来自不同细胞类型的分离胞外体产生了不同基因型的胞外 体。 (b)来自不同条件的胞外体胞外体产生细胞在某种条件下的生长会引起细胞改变，随后形成经遗传修饰的胞 外体。然后这些胞外体可用于将一组核酸转移到受体细胞。 (c)来自不同人或疾病的胞外体 来自不同人或疾病的胞外体包含不同组的核酸。由于供体细胞来源和条件不同使 得胞外体的基因型不同。含有单一组核酸的胞外体能被分离以用于进一步向受体细胞递送 核酸。 (d)来自经遗传修饰的供体细胞的胞外体 胞外体产生细胞内的基因破坏或突变引起经遗传修饰的胞外体，这种胞外体能用 于向受体细胞递送其核酸。胞外体内存在的各种核酸的表达可能受到胞外体产生细胞的基 因操作的影响（消除或上调/下调）。例如，胞外体产生细胞内的基因破坏导致胞外体内缺少 相应的mRNA。同时，胞外体产生细胞内基因的上调或下调影响胞外体内相应mRNA的量。 特定核酸构建体（克隆基因、DNA片段和质粒、microRNA、siRNA、编码或非编码的 DNA和RNA)能通过经遗传修饰的胞外体转移到受体细胞。核酸构建体可以使用标准技术来 制造，如克隆、分离和RNA或DNA序列的扩增，以用于进一步到向胞外体内转化。 (a)利用其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转移核酸构建体的非治疗性或体外方法，包括：a)从供体细胞中分离胞外体；b)遗传修饰胞外体以直接导入选择的核酸构建体；和c)通过将含有选择的核酸构建体的胞外体转移到受体细胞，将所述选择的核酸构建体转移到所述受体细胞中。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：扬·奥洛夫·洛特温尔，哈迪·瓦拉迪，
申请(专利权)人：科迪亚克生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US