一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用。本发明专利技术利用设计的小麦赤霉病致病镰刀菌特异性引物对病原菌DNA进行PCR扩增，可从小麦赤霉病病原镰刀菌中得到条带单一的特异片段。本发明专利技术的检测方法操作简单，耗时少，通量大，可应用于疑似患病的麦穗、种子中快速、准确地检测小麦赤霉病病原菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于作物病害预警检测及防治
，涉及一种分子快速检测的方法与应用，具体涉及一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用。
技术介绍
小麦作为一种重要的粮食作物，全球种植广泛。在我国，小麦是第二大粮食作物，其种植面积与产量仅次于水稻，也是我国重要的商品粮和战略性的主要粮食品种。小麦病害的发生导致产量与品质下降，给小麦的生产带来很大的困难。小麦赤霉病（Fusariumheadblight，FHB）是小麦生产中的三大病害之一，对小麦生产的影响巨大且分布广泛，很多国家的小麦产区均有发生，是一种世界性病害，尤其是温暖潮湿的地区。赤霉病主要发生在我国的中部及长江中下游地区，在长江中下游地区发病较重，由于耕作制度与气候的变化，小麦赤霉病的流行区域已开始向山东等北部地区转移。小麦赤霉病的发生与流行带来了巨大的安全隐患，病原菌产生的毒素威胁着人畜的健康。小麦赤霉病是由镰刀菌属（Fusarium.spp）引起的一种真菌性病害，病原菌包括禾谷镰刀菌（F.graminearum）、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)、黄色镰刀菌（F.culmorum)、梨孢镰刀菌(F.poae)、雪腐镰刀菌(F.nivale)，其中禾谷镰刀菌是全世界范围内主要的致病菌，也是我国小麦赤霉病的主要病原菌，禾谷镰孢菌为致病优势种，约占94.5%。在生产上能快速准确地鉴定出小麦赤霉病致病菌对防治该病至关重要。对于小麦赤霉病的鉴定，传统的方法主要依据病原菌的形态特征，采集发病样品，进行组织分离，观察致病菌的形态及产孢方式等。由于形态鉴定的周期较长，步骤繁琐，对于镰刀菌的预警检测以及生产上对于小麦赤霉病的防治存在着一定的局限性。随着分子生物学技术的快速发展，分子鉴定被逐步应用在真菌的分类上。与传统的形态鉴定方法比较，分子鉴定简单，快速，具有较高特异性和灵敏性。用于镰刀菌属系统学研究的主要基因位点有β-tubulin，rDNA，EF-1α，这些靶标基因具有较高的物种特异性。但实际运用中，以上方法对于镰刀菌种间的鉴定也存在着一定的局限性，不能将镰刀菌鉴定到种。因而对于田间小麦赤霉病致病镰刀菌的快速、准确地鉴定，需要针对镰刀菌属的特异性靶标位点来开展。针对田间赤霉病的快速检测，生产上存在着不同的检测方法与体系，但主要针对禾谷镰刀菌单一致病菌，由于田间小麦赤霉病的致病菌种类较多，因此需要一种能够快速检测出小麦赤霉病致病镰刀菌的方法。
技术实现思路
本专利技术的主要解决的问题是提供了一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用，本专利技术可以直接从发病的麦穗或带菌的种子中检测出小麦赤霉病的致病镰刀菌。所述小麦赤霉病致病菌分子快速检测的方法应用于田间小麦赤霉病的早期诊断以及病菌的监测和鉴定。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物，所述引物的序列为：F1：5’-ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG-3’；R1：5’-TCATTCTACTGTCTCGCGTCGACG-3’。本专利技术还提供了利用所述的特异性引物检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方法，它包括以下步骤：（1）分离小麦中的病原菌；（2）提取病原菌的基因组DNA；（3）PCR反应程序；（4）PCR扩增产物通过电泳分析，当PCR产物呈现1655bp条带时，即检测到赤霉病病原镰刀菌。进一步的：所述步骤（1）中的病原菌取自小麦麦粒或小麦染病组织。进一步的：所述步骤（1）中分离病原菌的步骤为；切取小麦染病组织，置于乙醇中浸泡，然后移入升汞溶液中浸泡，再转移到无菌水中漂洗；最后将漂洗后的染病组织移至培养基上，进行培养3-5d。进一步的：所述PCR反应的体系为25μL，反应液为：10×buffer2.5μL，dNTP1μL，引物F1和R1各1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板3μL，ddH2O16μL。进一步的：所述PCR反应的程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃总延伸10min。进一步的：所述1655bp的序列如SEQIDNo:1所示。本专利技术还提供了所述的特异性引物在制备用于检测小麦赤霉病病原镰刀菌的试剂中的应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及技术效果：本专利技术利用了镰刀菌属特异性CYP51C基因（如SEQIDNo:1所示）作为检测靶标，通过比对分析小麦赤霉病致病镰刀菌与其他镰刀菌的CYP51C序列，设计一对特异性引物F1和R1，通过基本PCR操作，利用扩增的有无以及特异性条带的大小来鉴定出小麦赤霉病病原的存在。通过本专利技术技术方案可以对发病小麦进行定性检测，明确小麦赤霉病的存在及分布，为及时有效防治小麦赤霉病提供理论依据。与已有的赤霉病鉴定方法比较，本专利技术的独特之处在于：1.采用1对引物进行PCR扩增，操作方法和体系较简便；2.PCR扩增产物为一条带，结果特异，不需要多条带鉴定病原菌；3.病原菌鉴定范围较广，并非针对一种致病菌，鉴定方法适用于田间小麦赤霉病多种病原菌的鉴定；4.本专利技术检测方法灵敏度较高，所需DNA较少，20ngDNA便可检测到结果，确保从麦穗中检测出致病菌。附图说明图1是利用本专利技术设计的特异性引物的PCR扩增结果，其中M:DL2000DNAMarker1：禾谷镰刀菌；2：燕麦镰刀菌；3：腐皮镰刀菌；4：尖孢镰刀菌株；5：链格孢菌株；图2是本专利技术实施例2中不同地区田间采集菌株的PCR扩增结果，M:DL2000DNAMarker，1-9菌株信息详见表1；图3是本专利技术实施例3中麦粒DNA的PCR扩增结果，M:DL2000DNAMarker，1-9菌株信息详见表1。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细的描述。一、已知菌株的PCR鉴定1、菌株DNA提取取禾谷镰刀菌株、燕麦镰刀菌株、腐皮镰刀菌株、尖孢镰刀菌株和链格孢菌株，上述菌株为本实验室保存，也可以采用商品化的菌株。1）挑取上述5种菌株的菌丝于PDA培养基，25℃培养4d，利用CTAB法提取DNA；2）用灭菌牙签刮取PDA平板上的少量病原菌菌丝，置于研钵中用液氮磨至粉状，装入2.0ml的离心管中；3)加入700μl2%的CTAB抽提液，将离心管置于65℃的水浴槽中，每隔10min振荡混匀一次，60min后取出，冷却至室温；4)加入等体积的酚与氯仿（1:1），剧烈本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物，其特征在于所述引物的序列为：F1：5’‑ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG‑3’；R1：5’‑TCATTCTACTGTCTCGCGTCGACG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物，其特征在于所述引物的序列为：
F1：5’-ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG-3’；
R1：5’-TCATTCTACTGTCTCGCGTCGACG-3’。
2.利用权利要求1所述的特异性引物检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方法，其特
征在于它包括以下步骤：
（1）分离小麦中的病原菌；
（2）提取病原菌的基因组DNA；
（3）PCR反应程序；
（4）PCR扩增产物通过电泳分析，当PCR产物呈现1655bp条带时，即检测到赤霉病病
原镰刀菌。
3.根据权利要求2所述的检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方法，其特征在于：所
述步骤（1）中的病原菌取自小麦麦粒或小麦染病组织。
4.根据权利要求3所述的检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方法，其特征在于：所
述步骤（1）中分离病原菌的步骤为；切取小麦染病组织，置于乙醇中浸泡，然后...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金光，钱恒伟，迟梦宇，孙晓梅，赵颖，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37