本发明专利技术公开了一株水貂绿脓杆菌血清C型菌株及其应用，属于水貂绿脓杆菌菌株的分离和应用领域。本发明专利技术从多例疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺脏中，通过分离、鉴定和筛选等方法，最终得到一株致病力强、稳定性高的水貂绿脓杆菌血清C型WD013菌株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12145。本发明专利技术还公开了用该菌株制备灭活疫苗的方法，包括：培养菌株，获得菌液；加入灭活剂，将菌液灭活；混匀佐剂和菌液，配苗，即得。安全性、效力试验证明，用本发明专利技术所分离的水貂绿脓杆菌血清C型WD013菌株制备的灭活疫苗具有较高的安全性和良好的免疫效力，对于绿脓杆菌所致的水貂出血性肺炎能够提供好的临床保护。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一株水貂绿脓杆菌血清C型菌株及其应用，属于水貂绿脓杆菌菌株的分离和应用领域。本专利技术从多例疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺脏中，通过分离、鉴定和筛选等方法，最终得到一株致病力强、稳定性高的水貂绿脓杆菌血清C型WD013菌株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12145。本专利技术还公开了用该菌株制备灭活疫苗的方法，包括：培养菌株，获得菌液；加入灭活剂，将菌液灭活；混匀佐剂和菌液，配苗，即得。安全性、效力试验证明，用本专利技术所分离的水貂绿脓杆菌血清C型WD013菌株制备的灭活疫苗具有较高的安全性和良好的免疫效力，对于绿脓杆菌所致的水貂出血性肺炎能够提供好的临床保护。CGMCC No.1214520160224【专利说明】水貂绿脓杆菌血清C型菌株及其灭活疫苗和应用
本专利技术涉及水貂绿脓杆菌，尤其涉及一株水貂绿脓杆菌血清C型菌株，本专利技术进一 步涉及用该菌株制备的预防水貂出血性肺炎的灭活疫苗，属于水貂绿脓杆菌的分离和应用 领域。
技术介绍
水紹出血性肺炎是由绿脓杆菌(又称铜绿假单胞菌，Pseudomonas aeruginosa)感 染引起的一种高度致死性传染病，多发于每年9至11月份，该菌可通过患病水貂形成的飞沫 及气溶胶传播。发病急、死亡快，所以又称铜绿假单胞菌肺炎，以呼吸困难、口鼻出血、突发 性死亡为主要特征，死后典型症状为口鼻流出血样泡沫，剖检肺脏呈弥漫性出血。 绿脓杆菌，属于Y变性菌门假单胞菌科，为需氧或兼性厌氧菌的革兰氏阴性杆菌。 目前对绿脓杆菌分型常用方法是血清学分型，国际血清分型系统根据菌体〇抗原将其分为 20个不同的血清型。日本科学家Homma根据0抗原将绿脓杆菌分为A~N群，并且根据此系统 形成的试剂盒在国际社会形成广泛应用。绿脓杆菌为条件致病菌，广泛存在于环境中，接种疫苗是预防该病的有效方法，同 时避免了使用抗生素导致菌株产生耐药性。中国于上世纪80年代初首次报道了水貂出血性 肺炎病例，尤其2000年以来在中国山东、河北、辽宁、山西、吉林等多地相继暴发了水貂出血 性肺炎，死亡率为6%-54%，调查发现中国各地水貂出血性肺炎C型流行率为30%~40%不 等，由于各血清型之间无交叉保护，制备的单苗具有针对性。因此，研制一种防治水貂出血 性肺炎的安全性好、保护效力高的灭活疫苗具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一株致病力强、稳定性高的水貂绿脓杆菌血清C型菌株； 本专利技术的目的之二是将所分离的水貂绿脓杆菌血清C型菌株应用于防治水貂出血 性肺炎。 本专利技术的目的之三是提供一种制备防治水貂出血性肺炎的灭活疫苗的方法。 本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 本专利技术从多例疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺脏中，通过分离、鉴定、筛 选、检测最终得到了 14株血清C型菌株，对14株菌株的致病力进行筛选，得到致病力较好的5 株血清C型菌株，对5株菌株稳定性进行筛选最终得到了稳定性高的绿脓杆菌血清C型WD013 株，将分离的菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为:CGMCC No. 12145; 分类命名为:铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。保藏单位：中国微生物保藏管理委员 会普通微生物中心;保藏时间是：2016年2月24日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所。 本专利技术无菌采集疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺脏，接种2%牛血清肉汤 琼脂平板，37°C过夜培养，挑取疑似单菌落划线接种绿脓素测定用培养基(PDP)，37°C培养 24小时，挑取阳性菌落接种5ml 2 %牛血清肉汤培养基，37 °C培养过夜，记为F0代。经过PCR 鉴定、16S rRNA基因序列进行分析，结果表明：PCR鉴定为阳性，测序结果与预期相符，符合 片段大小为956bp。然后对其形态、生化特性、培养特性进行分析，结果表明，分离株符合绿 脓杆菌的形态、生化及培养特性，初步鉴定为阳性的菌液。对初步鉴定为阳性的菌液进行血 清型鉴定检测，筛选出14株血清C型菌株。然后对血清C型菌株进行纯化，得到编号DL001、 DL002、SD003、DL004、SD005、DL006、PL007、DL008、LN009、DL010、LN011、SD012、WD013和 SD014菌株。然后，对上述14株血清C型菌株的致病力进行筛选，得到致病力较好的5株C型菌 株：01001、50005、？1007、1^009和10013。进一步对将绿脓杆菌血清(：型01001株、50005株、 PL007株、LN009株和WD013株的稳定性进行筛选，最终得到了稳定性高的绿脓杆菌血清C型 WD013株。为了验证本专利技术绿脓杆菌血清C型WD013株的免疫效力，本专利技术对绿脓杆菌血清C 型WD013株的毒力和免疫原性进行测定，毒力测定表明：绿脓杆菌血清C型WD013株对小鼠的 LD5〇为8.11 X 105CFU;对2~5月龄水貂LD5Q为2.53 X 106CFU。免疫原性测定表明：用该分离株 F1代制备的疫苗免疫2~5月龄水貂5只，免后21日，以10LD 5Q进行攻毒，免疫组保护率为5/5， 对照组保护率为0/5。以上结果表明绿脓杆菌血清C型WD013株分离株F1代免疫原性良好。 进一步的，本专利技术将绿脓杆菌血清C型WD013株制备成三批灭活疫苗，对非靶动物、 对靶动物单剂量和超剂量进行安全性试验，结果表明：非靶动物、靶动物临床表现均正常， 注射局部和全身无不良反应，全部存活。对灭活疫苗的效力进行试验，结果表明：对于水貂： C型灭活疫苗免后21日攻毒，三批疫苗对免疫组水貂保护率均不小于80%，对照组水貂均 100%发病;对于小鼠：免后21日攻毒，三批疫苗对免疫组小鼠保护率均不小于90%，对照组 水貂均100%发病。对免疫持续期进行试验，结果表明：C型灭活疫苗对水貂抗绿脓杆菌 WD013株的保护期为6个月，免疫保护率均不小于80%。以上说明血清C型WD013株安全性较 好，能够提供好的临床保护。 本专利技术还提供了血清C型WD013株在制备防治水貂出血性肺炎的应用。 为此，本专利技术提供了一种防治水貂出血性肺炎的疫苗组合物，包括:预防或治疗上 有效量本专利技术所分离的绿脓杆菌血清C型WD013菌株以及药学上可接受的佐剂。 本专利技术进一步提供了一种制备所述防治水貂出血性肺炎的疫苗组合物的方法，该 方法包括： (1)培养绿脓杆菌血清C型WD013株，得到菌液； (2)向菌液中加入灭活剂，将菌液灭活； (3)灭活后的菌液与佐剂混合均匀，配苗，即得。 步骤（1)中将血清C型WD013株接种含2%牛血清肉汤琼脂平板，37°C过夜培养，挑 取单个典型菌落进行扩大培养，按培养基体积总量的1 %接种TSB培养基，37 °C通气搅拌培 养； 步骤(2)中向菌液中加入的灭活剂是甲醛，加入甲醛至其终浓度为菌液体积总量 的0.1%，灭活24小时。 步骤(3)中，所述的佐剂为氢氧化铝胶，其中，氢氧化铝胶为体积百分比为30%氢 氧化铝胶。 本专利技术技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：本专利技术所分离的水貂绿脓杆菌血清C型WD013菌株致病力强、稳定性高，其制备的 灭活疫苗具有较高的安全性和良好本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株水貂绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)血清C型菌株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12145。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨朋欣，丁国杰，刘可姝，梁宛楠，关俊威，张凤强，窦海艳，常超，姜宇，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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