一种二氯甲烷法提取DNA的原理制造技术

本发明专利技术属于DNA提取技术领域且公开了一种有机二氯甲烷法提取DNA的原理，核DNA的提取原理是：以低渗法裂解细胞，之后通过离心收集细胞核，核内DNA通过加入SDS、Triton、Tween20等去垢剂或加热煮沸法将细胞膜、核膜破坏，使DNA从细胞核内释放，再加入蛋白酶K，水解膜蛋白和核蛋白，使DNA游离在溶液中，随后以不同的方法去除杂质，收集DNA，抽提DNA中最为经典的为有机法。传统的有机提取法(即经典的饱和酚－氯仿法)：利用有机的蛋白质变性剂酚、氯仿(三氯甲烷)交替抽提，使蛋白质变性，有效地去除蛋白质等杂质，该二氯甲烷法提取DNA的原理，克服酚的缺点，加速有机相与液相分层，最后用更加环保的另一种有机溶剂‑二氯甲烷进行抽提DNA，去除核酸溶液中的迹量酚，得到了同样高质量和高浓度的DNA。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于DNA提取
且公开了一种有机二氯甲烷法提取DNA的原理，核DNA的提取原理是：以低渗法裂解细胞，之后通过离心收集细胞核，核内DNA通过加入SDS、Triton、Tween20等去垢剂或加热煮沸法将细胞膜、核膜破坏，使DNA从细胞核内释放，再加入蛋白酶K，水解膜蛋白和核蛋白，使DNA游离在溶液中，随后以不同的方法去除杂质，收集DNA，抽提DNA中最为经典的为有机法。传统的有机提取法(即经典的饱和酚－氯仿法)：利用有机的蛋白质变性剂酚、氯仿(三氯甲烷)交替抽提，使蛋白质变性，有效地去除蛋白质等杂质，该二氯甲烷法提取DNA的原理，克服酚的缺点，加速有机相与液相分层，最后用更加环保的另一种有机溶剂?二氯甲烷进行抽提DNA，去除核酸溶液中的迹量酚，得到了同样高质量和高浓度的DNA。【专利说明】一种二氯甲烷法提取DNA的原理
本专利技术涉及一种有机法提取DNA的原理，具体涉及一种二氯甲烷法提取DNA的原理，属于DNA提取

技术介绍
脱氧核糖核酸(缩写为DNA)又称去氧核糖核酸，是一种分子，双链结构，由脱氧核糖核苷酸(成分为:脱氧核糖、磷酸及四种含氮碱基)组成。可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作，主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”，其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物，如蛋白质与RNA所需，带有遗传讯息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现，组成简单生命最少要265到350个基因。现有有机法DNA提取主要原料为三氯甲烷(又名氯仿)，但是三氯甲烷是现在制作冰毒的必需原料，属于限购试剂，在实验中很难正常买到;其次，三氯甲烷具有高腐蚀性和毒性，对我们的环境和生活有着严重的影响，为了更为有效和环保的进行实验，我们尝试了在这个DNA提取方法中将二氯甲烷(易购买，毒性小)替代三氯甲烷(又名氯仿)，结果得到了同样高浓度和高质量的DNA，为此，我们提出一种有机二氯甲烷法提取DNA的原理。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题克服现有的缺陷，提供一种二氯甲烷法提取DNA的原理，该二氯甲烷法提取DNA的原理，克服三氯甲烷自身的缺点；加速有机相与液相分层，最后用更为环保并效果相同的二氯甲烷替代三氯甲烷抽提DNA，去除核酸溶液中的迹量酚，不仅保证了 DNA的提取率，而是更加环保和切合实际的提供另一种有机的DNA提取方法，有效解决
技术介绍
中的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案:(I)血液(痕):取血液ΙΟΟμΙ (血痕0.5cm2)置1.5ml移液器管中，加入400μ1 TES(1mmoI/L缓冲液，pH 8.0，100mmol/L氯化钠，lmmol/L EDTA),10%SDS 40μ1,10mg/ml ΡΚ8μ1，37Γ水浴过液，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提I次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA，置-20 °C 2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，70%_75%乙醇洗涤1000rpm 5min，弃乙醇，DNA干燥后加适量ddH20(pH 8.2)溶解备用。(2)组织:取1mg左右组织，研磨后，置I.5ml移液器管中，加入400μ1 TES，1 %SDS40yia0mg/ml ΡΚ12μ1，后继步骤同⑴。(3)毛根:取4-6根带毛囊毛发(0.3cm)，置0.5ml移液器管中，加入ΙΟΟμΙ TES,10%SDS 10yia0mg/ml ΡΚ8μ1，39mmol/L DTT 10μ1，后继步骤同⑴。(4)唾液斑:取唾液斑1.0-2.0cm2，剪碎，TES浸泡Ih，用灭菌牙签搅动载体以使细胞脱离载体，去载体，1000rpm离心1min，弃上清，于沉淀内加入400μ1 TES, 10%SDS 40μlaOmg/ml PK8yl，37°C过夜或56°C两小时，后继步骤同⑴。(5)混合斑:取混合斑0.5cm2，剪碎，TES4°C浸泡2h，去载体，1000rpm离心10_，弃上清液，于沉淀内加入400μ1 TES ,10% SDS 40μ1,10mg/ml ΡΚ8μ1，52°C3h，用TES反复洗涤3次除去阴道上皮细胞，方法①再加入400μ1 TESa0%SDS40yl,10mg/ml PK15yl，39mmDTT40yl，37 °C过夜或56 °C 2小时，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2_4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提I次。加2倍体积冷无水乙醇和I/10体积3mo 1/L氯化钠沉淀DNA，置-20°C2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，DNA干燥后加适量ddH20(pH 8.2)溶解备用；方法②加入 5%CHELEX-100 ΙΟΟμΙ，10mg/ml PK10yl,39mm DTT20yl，37°C 过夜或 56°C2小时，剧烈振荡，100 °C加热1min，剧烈振荡，10000r-min 1min，取上清液进行检测扩增。(6)骨、指甲:同血液DNA提取，骨和指甲的消化时间延长至3天到I周，蛋白酶K用量为25μ1 (20mg/ml)左右，消化时加入适量39mM DTT。(7)污染检材DNA提取:检材用TES液洗涤1-2次后以酚-二氯甲烷法提取DNA，提取的DNA经无水乙醇、3M氯化钠涫淀后再加入TES、10mg/ml PK、10%SDS进行二次消化，再以酸-二氣甲烧法提取DNA。本专利技术所达到的有益效果是:一种二氯甲烷法提取DNA的原理，采用酚抽提细胞DNA，能够使蛋白质变性，同时抑制了脱氧核糖核酸酶的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相，使用酚的优点:1.有效变性蛋白质;2.抑制了脱氧核糖核酸酶的降解作用，采用二氯甲烷抽提细胞DNA，克服酚的缺点；加速有机相与液相分层，最后用二氯甲烷抽提，去除核酸溶液中的迹量酚。通过这种改良的有机法(即酚-二氯甲烷法)最后提取到了和三氯甲烷相同效果的DNA，改进了一种更加环保、实用的科研实验方法。【具体实施方式】以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例:本专利技术一种二氯甲烷法提取DNA的原理:(I)血液(痕):取血液ΙΟΟμΙ (血痕0.5cm2)置1.5ml移液器管中，加入400μ1 TES(1mmoI/L缓冲液，pH 8.0，100mmol/L氯化钠，lmmol/L EDTA),10%SDS 40μ1,10mg/ml ΡΚ8μ1，37Γ水浴过液，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提I次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA，置-20 °C 2h后100001'/111；[11离心20111；[11，倾去无水乙醇，70%_75% 乙醇洗涤1000rpm 5min，弃乙醇，DNA干燥后加适量ddH20(pH 8.2)溶解备用。(2)组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种二氯甲烷法提取DNA的原理，其特征在于，各种生物样本具体DNA提取操作方法：(1)血液(痕)：取血液100μl(血痕0.5cm2)置1.5ml移液器管中，加入400μl TES(10mmol/L缓冲液，pH 8.0，100mmol/L氯化钠，1mmol/L EDTA)，10％SDS 40μl，10mg/ml PK8μl，37℃水浴过液，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2‑4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA，置‑20℃2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，70％‑75％乙醇洗涤10000rpm 5min，弃乙醇，DNA干燥后加适量ddH2O(pH 8.2)溶解备用；(2)组织：取10mg左右组织，研磨后，置1.5ml移液器管中，加入400μl TES，10％SDS 40μl，10mg/ml PK12μl，后继步骤同⑴；(3)毛根：取4‑6根带毛囊毛发(0.3cm)，置0.5ml移液器管中，加入100μl TES，10％SDS 10μl，10mg/ml PK8μl，39mmol/L DTT 10μl，后继步骤同⑴；(4)唾液斑：取唾液斑1.0‑2.0cm2，剪碎，TES浸泡1h，用灭菌牙签搅动载体以使细胞脱离载体，去载体，10000rpm离心10min，弃上清，于沉淀内加入400μl TES，10％SDS 40μl，10mg/ml PK8μl，37℃过夜或56℃两小时，后继步骤同⑴；(5)混合斑：取混合斑0.5cm2，剪碎，TES4℃浸泡2h，去载体，10000rpm离心10mm，弃上清液，于沉淀内加入400μl TES，10％SDS 40μl，10mg/ml PK8μl，52℃3h，用TES反复洗涤3次除去阴道上皮细胞，方法①再加入400μl TES，10％SDS40μl，10mg/ml PK15μl，39mm DTT40μl，37℃过夜或56℃2小时，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2‑4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA，置‑20℃2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，DNA干燥后加适量ddH2O(pH 8.2)溶解备用；方法②加入5％CHELEX‑100100μl，10mg/ml PK10μl，39mm DTT20μl，37℃过夜或56℃2小时，剧烈振荡，100℃加热10min，剧烈振荡，10000r‑min10min，取上清液进行检测扩增；(6)骨、指甲：同血液DNA提取，骨和指甲的消化时间延长至3天到1周，蛋白酶K用量为25μl(20mg/ml)左右，消化时加入适量39mM DTT；(7)污染检材DNA提取：检材用TES液洗涤1‑2次后以酚‑二氯甲烷法提取DNA，提取的DNA经无水乙醇、3M氯化钠涫淀后再加入TES、10mg/ml PK、10％SDS进行二次消化，再以酚‑二氯甲烷法提取DNA。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：聂胜洁，胡利平，顾涛，张秀峰，聂爱婷，饶旼，王尚文，杜雷，刘建兴，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南;53