本发明专利技术公开了一种检测辣椒环斑病毒的RT‑LAMP引物和试剂盒及方法，属于于植物保护领域。该RT‑LAMP引物包括如SEQ ID NO.1所示的引物F3、如SEQ ID NO.2所示的引物B3、如SEQ ID NO.3所示的引物FIP和如SEQ ID NO.4所示的引物BIP。本发明专利技术提供的试剂盒包括前述引物。本发明专利技术提供的检测辣椒环斑病毒的方法包含如下步骤：以待测样品的RNA为模板，利用前述RT‑LAMP引物或试剂盒进行RT‑LAMP扩增反应；反应结束后通过肉眼观察RT‑LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断为阳性反应；若反应液显橙色，则判断为阴性反应。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测辣椒环斑病毒的RT?LAMP引物和试剂盒及方法，属于于植物保护领域。该RT?LAMP引物包括如SEQ ID NO.1所示的引物F3、如SEQ ID NO.2所示的引物B3、如SEQ ID NO.3所示的引物FIP和如SEQ ID NO.4所示的引物BIP。本专利技术提供的试剂盒包括前述引物。本专利技术提供的检测辣椒环斑病毒的方法包含如下步骤：以待测样品的RNA为模板，利用前述RT?LAMP引物或试剂盒进行RT?LAMP扩增反应；反应结束后通过肉眼观察RT?LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断为阳性反应；若反应液显橙色，则判断为阴性反应。【专利说明】一种检测辣椒环斑病毒的RT-LAMP引物和试剂盒及方法
本专利技术属于植物保护领域，具体涉及一种检测辣椒环斑病毒的RT-LAMP引物和试 剂盒及方法。
技术介绍
辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus，ChiRSV)是近年才被发现的一种新病毒， 2009年被ICTV确定为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的确定种。 该病毒于2007年首次在越南报道，2011年在中国海南省首次报道了该病毒。2014-2015年， 本专利技术人利用小RNA测序和RT-PCR法，对为害广东辣椒的病毒种类进行鉴定中也发现该病 毒，且该病毒检出率在30 %以上。田间病株症状主要表现为叶片变小、花叶、畸形、花果败育 等，严重影响到辣椒的产量和品质。目前，检测ChiRSV的方法主要是反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)方法。RT-PCR检测方法主要包括:根据已知病毒保守序列设计RT-PCR引物，提取病 样中的总RNA，以其中的病毒基因组RNA作为模板，在PCR管中加入逆转录酶、模板、RT-PCR反 应成分，PCR仪上进行反应及琼脂糖凝胶电泳检测等步骤。该方法特异、较灵敏，但需要购买 专业仪器PCR仪，且较费时。目前利用RT-PCR检测病毒需要6小时左右。 环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP)技术，是利 用能识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合 酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。LAMP呈瀑布式扩增，其扩增效率非常 高，反应非常灵敏;利用识别靶序列上的6~8个特异性位点，其特异性很高;反应在60~65 °C恒温下进行，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单;整个检测反应只需1.0~ 1.5h，检测周期短。因此，该方法具有检测速度快、灵敏度高及不需要昂贵的专业仪器等优 点。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种检测辣椒环斑病毒 的RT-LAMP引物。 本专利技术的另一目的在于提供一种检测辣椒环斑病毒的试剂盒，该试剂盒含有上述 RT-LAMP引物。 本专利技术的又一目的在于提供一种利用上述RT-LAMP引物或试剂盒检测辣椒环斑病 毒的方法，该方法快速、灵敏、简便。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种检测辣椒环斑病毒的RT-LAMP引物，包 括一对外侧引物F3和B3以及一对内侧引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：， -种检测辣椒环斑病毒的试剂盒，包含上述检测辣椒环斑病毒的RT-LAMP引物。 所述的检测辣椒环斑病毒的试剂盒，还包含如下组分:RT-LAMP反应液、酶溶液和 核酸荧光染料； 所述的RT-LAMP反应液包含如下组分:40mM、pH8.8的Tris-HCl，浓度为20mM的KC1、 浓度为16mM的MgSCk、浓度为20mM的（NH4) 2S〇4、浓度为体积百分比0.2%的了￥661120、浓度为 1.61的甜菜碱(86七3丨116)、浓度为2.8111]\1的(1犯1 380 所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶的混合酶溶液。 所述的核酸荧光染料为荧光目视检测试剂。 -种检测辣椒环斑病毒的方法，包含如下步骤： 以待测样品的RNA为模板，利用RT-LAMP引物或试剂盒进行RT-LAMP扩增反应;反应 结束后通过肉眼观察RT-LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断为阳性反 应;若反应液显橙色，则判断为阴性反应。 所述的RT-LAMP扩增反应的反应体系为25yL反应体系，包含如下组分:RT-LAMP反 应液12 ? 5yL，酶溶液1 ? OyL，40pmol/yL引物FIP 和BIP各1 ? OyL，lOpmol/yL 引物F3 和 B3 各0 ? 5y L，核酸荧光染料1. OyL，RNA模板1. OyL，及去离子水6.5此。所述的RT-LAMP扩增反应的条件为:在63°C恒温条件下，扩增反应60min后，加热至 80°C，恒温反应5min使酶失活。所述的RT-LAMP引物或试剂盒在植物病毒检测领域中的应用。所述的植物病毒为辣椒环斑病毒或疑似辣椒环斑病毒。 本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果： (1)简便易操作:本专利技术的方法只需要恒温水浴锅或者稳定热源的设备就能进行 实验，且实验结果通过肉眼观察反应液的颜色就可以判断，不需要专业的仪器，非专业人员 均可操作，鉴定方法适应性强，克服了常规PCR专业性强及需要专用仪器设备等局限性，从 而达到实际生产中对植物病害鉴定快速、准确的要求。 (2)快速高效:本专利技术的检测方法鉴定周期为1小时，常规的RT-PCR检测鉴定方法 需要6小时左右，这样大大提高了检测效率。 (3)特异性强:本专利技术是通过2对引物识别靶序列上6个特异区域，而常规PCR是通 过识别靶序列上2个特异区域，因此大大提高了特异性，减少假阳性的概率。 (4)灵敏度高：以辣椒病样总RNA进行10倍系列稀释后用作模板，分别进行RT-LAMP 反应和普通RT-PCR反应。RT-LAMP和常规RT-PCR均可以在10- 2倍稀释模板中检测到，表明RT-LAMP检测方法和常规RT-LAMP检测灵敏度一样。【附图说明】 图1是引物筛选结果分析图，其中：管1、3、5为阳性病样，管2、4、6为阴性对照，管1、 2为第1组引物反应结果，管3、4为第2组引物反应结果，管5、6为第3组引物反应结果。图2是RT-LAMP灵敏度实验颜色反应结果分析图。图3是RT-PCR灵敏度电泳结果分析图。图4是RT-LAMP检测田间辣椒病样检测结果分析图，其中：管1~5为疑似辣椒病样， 管6为阳性对照，管7为健康的辣椒叶组织（阴性对照）。图5是RT-PCR检测田间辣椒病样的电泳结果分析图，其中：泳道M为2000bpmarker， 泳道1~5为疑似辣椒病样，泳道6为阳性对照，泳道7为健康的辣椒叶组织（阴性对照）。【具体实施方式】下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限 于此。实施例1:引物的设计 根据GenBank中已登录的辣椒环斑病毒多聚蛋白的基因序列（GenBank序列登录 号:JQ234922)，设计引物，分别包含外侧引物对F3和B3以及内侧引物对FIP和BIP，设计完成 后将引物在NCBI数据库中Primer-Blast模块下进行比对验证，最终选取以下RT-LAMP引物 组，均为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测辣椒环斑病毒的RT‑LAMP引物，其特征在于：包括一对外侧引物F3和B3以及一对内侧引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：F3:5’‑TGGTTTGGTGCATTGTGTA‑3’；B3:5’‑GCAAACCATACCTTGGCA‑3’；FIP:5’‑GGTACTCAACTTGTTCATCACCAGAACATCACCAAATCTAAATGGAAT‑3’；BIP:5’‑TCATGCTAGACCAACTTTTAGACAATCTCTGCATTACGCTTCTC‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汤亚飞，何自福，佘小漫，蓝国兵，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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