本发明专利技术公开了一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库及其制备方法。其文库包含羊口疮疫苗免疫骆驼的抗原剂量、免疫程序和血清抗体效价，制备文库包括以下步骤：骆驼外周血淋巴细胞分离、总RNA提取及mRNA分离、纯化；CDSⅢ和SMART引物逆转录合成全长cDNA，设计两套扩增引物，采用同源重组的方法将扩增产物与pGADT7共转染酵母细胞Y187；构建骆驼抗羊口疮病毒的VHH基因cDNA文库；计算文库库容量；扩增cDNA文库进行质量评价。本发明专利技术针对羊口疮病毒构建的cDNA文库是一种具备病毒特异性、生物学活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体文库，尤其是单域抗体之类的新型抗体，对于建立羊口疮病毒的临床诊断方法，研究病毒的感染机理具有极其重要的作用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库及其制备方法。其文库包含羊口疮疫苗免疫骆驼的抗原剂量、免疫程序和血清抗体效价，制备文库包括以下步骤：骆驼外周血淋巴细胞分离、总RNA提取及mRNA分离、纯化；CDSⅢ和SMART引物逆转录合成全长cDNA，设计两套扩增引物，采用同源重组的方法将扩增产物与pGADT7共转染酵母细胞Y187；构建骆驼抗羊口疮病毒的VHH基因cDNA文库；计算文库库容量；扩增cDNA文库进行质量评价。本专利技术针对羊口疮病毒构建的cDNA文库是一种具备病毒特异性、生物学活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体文库，尤其是单域抗体之类的新型抗体，对于建立羊口疮病毒的临床诊断方法，研究病毒的感染机理具有极其重要的作用。【专利说明】一种抗羊口疮病毒双峰职VHH重链单域抗体cDNA文库及其制 备方法
本专利技术涉及一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体CDNA文库及其制备方 法，属于生物
技术介绍
0RFV能引起羊和人类的接触性感染，近年该病在我国广泛流行，对养羊业及人类 健康构成威胁。作为痘病毒科副痘病毒属的代表成员之一，0RFV拥有鲜明的种属特性和基 因功能的多样性，其基因组属于两端闭合的双股DNA，长约138kb，中央为核心区（88kb)，两 端为反向重复序列（Inverted terminal repeat，ITR)，冠以环状发夹结构。中央核心区基 因相对保守，主要调控病毒的复制、包装和输出。研究发现0RFV凭借自生稳定遗传的载体优 势携带着一些特殊的基因，通过各种表达产物协同的限制宿主的免疫清除效应，发展和进 化了一整套的免疫调节策略，确立了病毒得以顺利复制和设计免疫逃逸。由此可见，0RFV与 宿主互作时，病毒的相关功能基因各尽其责，最终使病毒得以顺利复制和免疫逃逸。因此， 要建立0RFV早期快速诊断技术，明确0RFV的致病机理，需从病毒功能性抗体入手，通过病毒 新型纳米VHH抗体文库来筛选病毒功能抗体是解决该问题的关键，构建VHH cDNA文库是解 决该问题的基础。 纳米抗体从发现至今，已经发展为有广泛生物应用价值和临床应用价值的高度通 用分子。纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳 定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点的相互作用，使之作用类似于 抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有 重链，纳米抗体的制造较mAb容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳 定性，具有常规单域抗体无法比拟的水溶性和构象稳定性。这种单体结构域能高特异性、高 亲和力地与抗原结合，从而中和或封闭相对隐蔽的抗原表位。凭借以上特性单域抗体与普 通抗体相比有很大优势。单域抗体是目前可以得到的具有完整功能、稳定、可结合抗原的最 小单元，由于相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易表达及免疫原性低 等特点成为当前分子影像研究中的重要靶分子，这为工程化抗体提供了一个良好的来源， 具有广阔的应用前景。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很高的价值。 因此，综合目前在抗体领域的研究和利用情况，不难发现传统抗体类药物仍面临 着挑战，有必要设计和生产新一代更有效的抗体分子以满足临床的需要。特别是如何实现 抗体小型化，使其高效作用于特定部位。为此，实现抗体小型化靶向癌细胞内效应分子或者 其他靶细胞一直是抗体工程与抗癌研究的重要目标和研究热点。 文库的容量和多样性很大程度上影响从中淘选出特异性抗体的概率以及抗体的 亲和力。自1976年构建的第一个cDNA文库以来，其方法不断的改进，其中SMART( Switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)方法构建的cDNA文库能够代表原有样品中 mRNA的丰度，保存了生物遗传信息的完整性。而且该方法只需要25ng的mRNA或者50ng的 Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品 中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库。同时酵母双杂交技术能够从构 建的宿主细胞cDNA文库中筛选出与已知目的蛋白相互作用的蛋白。本专利技术成功构建了酵母 双杂交cDNA文库，该文库的库容为6.1 X 106cfu/ml，文库重组率为100 %，可为羊口疮及其 他羊病毒病基因功能及致病机理奠定基础。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术涉及一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库及其 制备方法，因VHH纳米抗体具有相对分子量小、组织穿透力强、体内清除快、易于大肠杆菌发 酵生产和进行基因工程改进的优点，因此比完整长度的单克隆抗体具有更大的优势和发展 前景。本专利技术针对羊口疮病毒构建的VHH cDNA文库是一种具备型特异性、生物学活性好、结 合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体文库，尤其是单域抗体之类的新型抗体，对于建立 羊口疮病毒的临床诊断方法，研究病毒的感染机理具有极其重要的作用。 本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题： 一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库，其包含羊口疮疫苗免疫 骆驼的抗原剂量、免疫程序和血清抗体效价。 -种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库，双峰驼免疫程序和抗原接 种剂量为，首免15头份、二免30头份、三免30头份，所述免疫程序为首免后第21天进行二免、 第35天进行三免，首次免疫前和每次免疫后采集静脉血，用0RFV抗体ELISA检测试剂盒检测 血清抗体效价，抗体达到实验要求后，静脉采血。 -种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备方法，其包括以下步 骤： (1)骆驼淋巴细胞分离、总RNA提取及mRNA分离、纯化； ⑵CDSm和SMART引物逆转录合成全长cDNA，设计两套扩增引物，采用同源重组的 方法将扩增产物与PGADT7共转染酵母细胞Y187; ⑶构建骆驼抗羊口疮病毒的VHH基因cDNA文库； (4)计算文库库容量； (5)扩增cDNA文库进行质量评价。 一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备方法，步骤（1)骆驼 淋巴细胞分离步骤如下，颈静脉采集骆驼抗凝血l〇〇ml，等量加入全血稀释液，混匀，以5:9 的比例先加淋巴细胞分离液，之后先慢后快加稀释好的抗凝血，水平离心机1800rpm，18-22 °C，20min，小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释之，水平离心机 lOOOrpm，18-22°C，lOmin,弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机lOOOrpm，18-22 °C，10min离心;弃上清，沉淀即为分离到的淋巴细胞，取悬浮细胞上清液并且计数后并悬浮 于RNAlater中，置-70°C保存备用。 一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备方法，步骤（1)总 RNA提取步骤为吸取上述淋巴细胞液400ul，加入lmlTRizol，混匀，4°C静置5min，加入200ul 三氯甲烷，混匀，室温静置31^11，1200(^/111111，4°(：，离心本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库，其特征在于：包含羊口疮疫苗免疫骆驼的抗原剂量、免疫程序和血清抗体效价。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田宏，吴锦艳，林彤，陈妍，尚佑军，郑海学，张克山，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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