一种筛选PD-1抗体的方法技术

本发明专利技术涉及一种筛选PD‑1抗体的方法，所述方法包括：将人PD‑1和PD‑L1全长基因分别构建到慢病毒表达载体中；然后分别转染到T和B淋巴细胞株；筛选出稳定表达的淋巴细胞；随后加入PD‑1单克隆抗体和T细胞超抗原SEE共同孵育48小时；最后根据上清中IL‑2含量的高低筛选所需的PD‑1单克隆抗体。本发明专利技术方法与SEB刺激全血分泌IL‑2的实验相比，在重复性和精确度方面更加优越，并且显著降低了实验成本，减少了操作人血液带来的各种潜在风险。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种筛选PD?1抗体的方法，所述方法包括：将人PD?1和PD?L1全长基因分别构建到慢病毒表达载体中；然后分别转染到T和B淋巴细胞株；筛选出稳定表达的淋巴细胞；随后加入PD?1单克隆抗体和T细胞超抗原SEE共同孵育48小时；最后根据上清中IL?2含量的高低筛选所需的PD?1单克隆抗体。本专利技术方法与SEB刺激全血分泌IL?2的实验相比，在重复性和精确度方面更加优越，并且显著降低了实验成本，减少了操作人血液带来的各种潜在风险。【专利说明】一种筛选PD-1抗体的方法
本专利技术涉及一种筛选抗体的方法，具体涉及一种筛选ro-i抗体的方法。
技术介绍
T细胞的活化启动和效应发挥的过程中至少需要两种信号存在，第一种信号是抗 原特异性的，由主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC)以及 与其结合的抗原肽被T细胞受体（T cell receptor，TCR)识别并结合后，由TCR复合物向 T细胞内传导激活信号；第二种激活信号是抗原非特异性的，是由抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC)和T细胞上多种辅助分子之间的配对和相互作用而提供的，能够提 供第二种激活信号的一类T细胞膜蛋白又被称为共刺激分子，其中CD28是一种表达在T细 胞表面的重要共刺激分子，在T细胞活化中发挥重要作用。当TCR与MHC-抗原肽复合物 结合后，如果共刺激分子缺乏，将导致T细胞对特异的抗原表现为无能状态，不仅不能被激 活，而且对抗原特异性的活化信号均不应答；如果共刺激分子如CD28与B7分子结合并激活 后，可在多个水平上介导T细胞的活化。活化的T细胞可以自分泌和旁分泌的形式产生白细 胞介素2 (interleukin 2 ;IL-2)，作用于细胞表面的受体IL2R，进一步刺激T细胞的增殖， 从而为发挥效应功能做好准备。 PD-1 (⑶279)是由288个氨基酸组成的免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白， 最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤中克隆，被认为与细胞凋亡相关而命名为程序性死 亡-1 (programmed death-1，ro-1)。ro-1是在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达的 CD28家族的抑制性成员（Okazaki 等（2002)Curr Opin Immunol 14:391779-82 ;Bennett等 (2003) J Immunol 170:711-8)，该家族还包括CD28、CTLA-4、IC0S和 BTLA等。PD-1 在活化的 B 细胞、T 细胞和髓样细胞上表达（Okazaki 等（2002) Curr. Opin. Tmmunol. 14:391779-82 ; Bennett等（2003)J Immunol 170:711-8)。ro-1含有接近膜的免疫受体酪氨酸抑制 基序（IHM)和远离膜的基于酪氨酸的转换基序（ITSM) (Thomas，M. L. (1995) J Exp Medl81:1953-6 ;Vivier，E 和 Daeron，M(1997) Immunol Todayl8:286-91)。虽然与 CTLA-4 结构类似，但ro-1蛋白因缺乏介导CD28/CTLA-4与B7-1/B7-2相结合的MYPPPY序列，以及 介导IC0S与IC0S-L相结合的FDPPPF序列，因而在结构上与CD28、CTLA-4及IC0S存在明 显差异。因此，PD-1与配体的结合非常特异，不与其他的B7家族分子产生交叉结合。 现已鉴定了 ro-1 的两种配体，分别是 ro-Ll (B7-H1)和 TO-L2 (B7-DC) (Latchman 等（2001) Nat Tmmuno 12:261-8 ;Carter 等（2002) Eur J Immunol32:634-43)。PD-L1 属于 B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部，PD-L1与其T细胞上的受体H)-l相互 作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用；该分子具有宽广的组织表达谱，广泛表 达于抗原提呈细胞（APCs)、活化T/B细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层、心肌内皮和胸腺皮质上 皮细胞。PD-L1在许多人类肿瘤组织中均可检测到ro-Li蛋白的表达，且许多癌组织较正常 组织中的H)-L1表达水平明显上调（Dong等人（2002)Nat. Med 8:787-9)。应用免疫组织 化学方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺 癌、神经胶质瘤、黑素瘤等人类肿瘤组织中检测到ro-Li蛋白的表达，且ro-Li的表达水平 和患者的临床及预后紧密相关。许多研究均表明ro-Li与肿瘤的免疫逃逸机制相关。研究 表明，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的apc表达的ro-Li均可经ro-i/PD-Li信号通路抑制肿 瘤抗原特异性T细胞的活化，下调t细胞介导的肿瘤免疫应答。大量实验证明，阻断ro-i/ PD-L1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增值，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，有效抑制肿 瘤生长。因此，干预ro-1/PD-Li信号有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。目前，对ro-1单克隆抗体进行体外评价的模型往往需要使用新鲜抗凝的人血液 或从人血中分离的白细胞，人血液来源比较困难，不仅成本较高而且存在潜在的生物危害 性。因此，建立一种稳定可靠的、能够在体外长期传代培养的细胞模型来评价ro-i抗体的 功能，一直是本领域的技术人员急待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种利用传代细胞筛选ro-i单克隆抗体的方法，该方法 能有效的筛选出特异性结合ro-i并促使淋巴细胞分必出il-2的单克隆抗体，且本专利技术方 法无需使用血液。 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案： -种筛选ro-i单克隆抗体的方法，包括以下步骤： 1、将人ro-i和ro-Li全长基因构建到慢病毒表达载体中； 2、将构建好的ro-1表达载体通过慢病毒转染的方法稳定转染到T淋巴细胞株；将 构建好的ro-Li表达载体通过慢病毒转染的方法稳定转染到b淋巴细胞株； 3、用抗生素G418筛选出稳定表达ro-1的T淋巴细胞和稳定表达ro-Ll的B淋巴 细胞； 4、稳定表达ro-1的T淋巴细胞和稳定表达ro-Ll的B淋巴细胞按照合适的比例 混合后，加入梯度稀释的ro-1单克隆抗体和T细胞超抗原SEE，然后共同孵育48小时； 5、用ELISA法检测细胞培养上清中的IL-2含量，根据IL-2含量的高低筛选所需 的ro-i单克隆抗体。 较佳的，所述载体为pLV-IRES-Neo载体。 较佳的，步骤4中，所述T淋巴细胞与B淋巴细胞按照1:1的细胞个数比混合。 较佳的，所述的T淋巴细胞株选自来源于小鼠、大鼠或人的在体外培养条件下可 以稳定传代的T淋巴细胞株；所述的B淋巴细胞株选自来源于小鼠、大鼠或人的在体外培养 可以稳定传代的B淋巴细胞株。优选所述的T淋巴细胞株为人T淋巴细胞株Jurkat ;所述 的B淋巴细胞株为人B淋巴细胞株Raji。 实验表明，PD-1单克隆抗体Nivolumab能够显著增强Raji细胞和SEE刺激Jurkat 细胞的IL-2分泌，并且这种作用具有剂量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选PD‑1单克隆抗体的方法，包括以下步骤：1)、将人PD‑1和PD‑L1全长基因分别构建到慢病毒表达载体中；2)、将构建好的PD‑1表达载体通过慢病毒转染的方法稳定转染到T淋巴细胞株；将构建好的PD‑L1表达载体通过慢病毒转染的方法稳定转染到B淋巴细胞株；3)、用抗生素G418筛选出稳定表达PD‑1的T淋巴细胞和稳定表达PD‑L1的B淋巴细胞；4)、筛选后的稳定表达PD‑1的T淋巴细胞和稳定表达PD‑L1的B淋巴细胞按照合适的比例混合后，加入梯度稀释的PD‑1单克隆抗体和T细胞超抗原SEE，然后共同孵育48小时；5)、检测细胞培养上清中的IL‑2含量，根据IL‑2含量的高低筛选所需的PD‑1单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵杰，张成海，朱玲巧，
申请(专利权)人：三生国健药业上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31