一种人干性记忆T细胞库的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种人干性记忆T细胞库的构建方法，包括以下步骤：(1)人外周血的采集；(2)外周血单个核细胞的分离；(3)初始T细胞的分选；(4)干性记忆T细胞的制备；(5)细胞冻存；(6)编码入库。本发明专利技术通过采用体外定向诱导的方法，可在短时间内获得足量的干性记忆T细胞(TSCM)并对其进行建库，该方法所需外周血体量小，具有成本低、实验室条件要求不高，操作简单等优点。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种人干性记忆T细胞库的构建方法，包括以下步骤：(1)人外周血的采集；(2)外周血单个核细胞的分离；(3)初始T细胞的分选；(4)干性记忆T细胞的制备；(5)细胞冻存；(6)编码入库。本专利技术通过采用体外定向诱导的方法，可在短时间内获得足量的干性记忆T细胞(TSCM)并对其进行建库，该方法所需外周血体量小，具有成本低、实验室条件要求不高，操作简单等优点。【专利说明】一种人干性记忆T细胞库的构建方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种人外周血免疫细胞库的构建方法，尤其涉及一种人干性记忆T细胞库的构建方法。
技术介绍
人外周血中含有多种免疫细胞，其中淋巴细胞是人体主要的免疫细胞类型，包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等，目前临床研究及应用上进行的免疫细胞治疗以T细胞为主，如TCR或CAR-T技术。自体来源的T细胞由于没有免疫原性可直接用于回输进行肿瘤等疾病治疗，同时其具有的记忆性特征在一定程度上还可以抑制疾病的复发。T细胞可从人外周血单个核细胞(PBMC)中分离获得，但由于外周血通常采自肿瘤或病毒感染的患者，体质虚弱，增加了采集的难度，同时其免疫细胞的增殖和抗疾病能力已经大大下降；而且已有研究表明，随着年龄的增长免疫细胞的生理功能也会逐渐下降，因此储存人体健康和年轻时期的免疫细胞，以便在出现疾病的时候进行治疗或年老时进行回输增强免疫力方面意义重大。近期，在人体内发现一种T细胞亚群，命名为干性记忆T细胞(stem memory Tcells,TSCM)，该细胞不仅具有很强的存活能力和抗肿瘤功能，而且具有干细胞的特性，能分化为中枢性记忆性T细胞(central memory T cel I s，TCM)、效应性记忆性T细胞(effector memory T cells，TEM)和效应性T细胞(effector T cells，TE)，保证机体具有持续不断的抗肿瘤和抗感染能力；同时又能进行自我更新，维持体内的TSCM数量。在表型上，TSCM和初始T细胞具有共同的表型特征CD45RA+、CD45R0-、CCR7+和CD27+，区别是其能高表达⑶95和⑶122，而其他记忆T细胞亚群也高表达⑶95和⑶122。在功能上，和其他类型T细胞相比，TSCM过继性回输后在体内的存活更具持久性，可以产生更持续的免疫应答，显示更好的抗肿瘤响应。同时TSCM具有干细胞的特性，在治疗的制备和量的需求上相对于其他细胞会小很多，可以大大缩短制备的时间和体外扩增所需要的费用。因此，TSCM细胞库的建立在免疫治疗中具有巨大的应用前景。由于TSCM在人循环外周血中所占的比例较低，约占T细胞的2-4%，而即使采用流式细胞术进行分离，大约每250个PBMC细胞才能分离I个CD4+TSCM细胞，而每500-1000个PBMC细胞才能分离I个CD8+TSCM细胞，对于规模化的细胞库构建来说，这种方法显然效率低下，对外周血的需求量大，制备费用昂贵。因此，如何研发一种对外周血的需求量小、制作成本低并且操作简单的人干性记忆T细胞库的构建方法已成为目前研究的重点。
技术实现思路
鉴于现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种人干性记忆T细胞库的构建方法，本专利技术通过体外定向分化的方法进行TSCM细胞库的构建，所需外周血体量小，具有成本低、实验室条件要求不高，操作简单，应用广等优点，从而推动TSCM细胞库的建设。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案: 一种人干性记忆T细胞库的构建方法，该方法包括以下步骤:(I)人外周血的采集；(2)外周血单个核细胞的分离；(3)初始T细胞的分选:采用免疫磁珠法对分离所得外周血单个核细胞进行初始T细胞的分选，抗体选用CD45RA和CD45R0的组合或CD45RA、CD45R0和CD95的组合；(4)干性记忆T细胞的制备;(5)细胞冻存；(6)编码入库。本专利技术在进行初始T细胞的分选时，采用免疫磁珠法对分离所得外周血单个核细胞进行初始T细胞的分选，其抗体可以采用CD45RA和CD45R0的组合或CD45RA、CD45R0和CD95的组合形式，优选采用⑶45RA、CD45R0和⑶95的组合。本专利技术通过采用上述抗体组合形式，尤其是采用CD45RA、CD45R0和CD95的组合，其能够获得纯度更高的靶向细胞，对于细胞的质量控制非常关键。根据本专利技术，步骤(I)所述人外周血的采集可以采用如下方法进行:采集外周血前，参与人应签署知情同意书，进行体格检查，需符合国家《血站基本标准》中有关血液采集的规定，利用人工或采血机进行外周血的采集，并将其存放于采血袋中。根据本专利技术，步骤(2)所述外周血单个核细胞的分离方法是:将采集的外周血进行分装和离心，取上清液得到自体血浆;分离下层血细胞，将其离心后得到外周血单个核细胞。优选地，所述外周血的离心是在室温下进行的；离心的转速优选为1500-2000rpm，例如 1500rpm、1600rpm、1650rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、1950rpm 或2000rpm，离心的时间优选为10-15min，例如 lOmin、10.5min、llmin、12min、12.5min、13min、14min 或 15min。本专利技术中，将外周血离心后，取上清液得到自体血浆，通常是将其置于-20°C保存备用。优选地，所述下层血细胞的分离是采用生理盐水对其进行稀释，将稀释后的血细胞加入淋巴细胞液液面上方进行分离；其中生理盐水与下层血细胞可以按1:1的比例进行配制；另外，还需将稀释后的下层血细胞加入到1-3倍体积的淋巴细胞分离液液面上方进行离心。优选地，所述下层血细胞的离心是在室温下进行；离心的转速优选为1800-2000rpm，例如 1800rpm、1820rpm、1850rpm、1870rpm、1900rpm、1920rpm、1950rpm 或 2000rpm，离心的时间优选为20_30min，例如20min、20.5min、21min、22min、22.5min、23min、24min、25min、28min、29min或30mino本专利技术中，将下层血细胞进行离心后，需将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即是外周血单个核细胞。示例性地，步骤(2)所述外周血单个核细胞的分离过程具体如下:将采集的外周血分装到离心管中，1500-2000rpm室温离心10-15min，取上清液得至IJ自体血浆，置于-20°C保存备用;分离自体血浆后，用生理盐水按1:1的比例稀释下层血细胞，将稀释的血细胞加入到1-3倍体积的淋巴细胞分离液液面上方，1800-2000rpm室温离心20-30min，离心后将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即是外周血单个核细胞。根据本专利技术，步骤(3)所述抗体⑶45RA采用正分选法，CD45R0和⑶95采用负分选法。优选地，步骤(3)所述抗体选用CD45RA、CD45R0和CD95的组合形式，其中，抗体⑶45RA采用正分选法，CD45R0和⑶95采用负分选法。采用该组合形式的抗体能够最大程度地提高靶向细胞的纯度和质量。根据本专利技术，步骤(4)所述干性记忆T细胞的制备方法是:先对初始T细胞进行诱导培养，收集、洗涤诱导培养后的细胞，再对其进行扩增培养。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人干性记忆T细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)人外周血的采集；(2)外周血单个核细胞的分离；(3)初始T细胞的分选：采用免疫磁珠法对分离所得外周血单个核细胞进行初始T细胞的分选，抗体选用CD45RA和CD45RO的组合或CD45RA、CD45RO和CD95的组合；(4)干性记忆T细胞的制备；(5)细胞冻存；(6)编码入库。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙长斌，张曦，张家文，周欣，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44