本发明专利技术以对巯基苯乙炔为主体结构设计了一系列拉曼散射峰位在1800‑2400 cm‑1波数区信号分子，选择金、银纳米粒子作为拉曼信号的增强基底，将带巯基的炔烃信号分子自组装于增强基底表面并使用巯基乙酸对SERS信号进行优化，然后选择透光、亲水并富含活性反应基团的包裹材料进行探针封装，最后在包裹材料外层嫁接特定的生物靶向功能分子。此探针拉曼散射的光学响应强、窄带单峰发射、无光学背景干扰，在多组分同时标记的生物成像领域意义重大。该技术可延伸至以带通滤光片为分光器件，以光电倍增管（PMT）或雪崩光电二极管（APD）为检测器件的无光栅超快拉曼成像仪的设计与开发，克服了拉曼成像逐点扫描、成像慢的技术瓶颈，将填补光学成像类仪器的市场空白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物成像
，涉及一种新型炔烃编码、生物靶向的表面增强拉曼散射(Surface-enhancedRamanscattering,SERS)活性纳米标记探针的制备方法。更重要的是，涉及以带通滤光片为分光器件，以光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)为检测器件的无光栅超快拉曼成像仪的设计与开发。
技术介绍
生物成像(如活细胞成像)技术使得科学家可以实时和动态观察生物体内部结构和生理过程，彻底革新了生物学家研究生物体活动机制的方式。在众多的生物成像技术中，荧光标记成像应用最为广泛和成熟。它利用可吸收特定波长的光并发射出波长更长的光(荧光)的信号探针，比如小分子有机染料或者荧光蛋白来特异性地标记生物体系中的特定组分，并通过其荧光信号的定位来获取目标生物物质的分布情况，极大地提升了人们探索生物体内部结构和过程的能力。然而，这种成像技术明显受制于荧光光谱法的固有缺陷，即传统的荧光染料发射峰宽(约50nm)过宽会造成多色(或多组分)标记时信号重叠而难以区分、辨析。量子点技术近年来的进展克服了上述传统有机荧光染料和荧光蛋白的固有缺陷，其发射峰窄且对称，相互重叠小以及其发射峰波长可由其组成材料和粒径进行精细调节等优良特性倍受细胞标记和成像研究的青睐，但其潜在的生物毒性使其应用于活体成像的一些深入研究难有新的进展。表面增强拉曼散射(Surface-enhancedRamanscattering,SERS)技术除具有非破坏性、高光谱特异性和不受水干扰等普通拉曼光谱的优点外，还具有更低的检测限和更高的灵敏度(具备单分子检测的能力)，特别是在纳米技术强势介入生物医学领域的情形下，各种具有表面增强拉曼散射效应的金(银)纳米颗粒广泛应用于生物样品的分析检测与生物成像研究。为了提高拉曼检测的灵敏度，人们对SERS基底材料的选择和制备进行了大量的研究。然而，作为另一个决定探针优劣的重要因素，信号分子的选择和设计却并未引起人们足够的重视。新颖的信号分子的提出通常需要经过合理的设计，仔细的筛选和系统的表征，相较于选择“现成”的SERS探针而言则无疑显得过于繁琐，从而造成了现如今关于信号分子设计的工作少之又少。但是在复杂的研究体系当中，SERS探针分子的随意选用却可能会成为研究进一步发展的障碍，因为干扰分子或检测分子与传统的SERS信号分子极易发生光谱重叠的现象，这将会严重影响结果的精确性。随着多目标同时检测概念的提出，这一困扰甚至会延伸至各类SERS探针分子之间，这时传统信号分子选择的困难性将会进一步被放大。面对如此困境，人们迫切需要大量相互无重叠的新颖信号分子用于复杂体系的抗干扰、多目标分析检测。炔基的拉曼特征峰在2120cm-1附近，在这一光谱区域细胞内常见的干扰物质是没有拉曼响应的，所以近些年在不少研究中人们将炔烃标记的生物代谢分子，如DNA、RNA、蛋白质、脂类等用于生物标记成像并取得了不错的效果；此外，炔基的拉曼位移和强度会因为与之相连的取代基的不同而发生明显偏移，甚至仅仅是将炔基的碳原子12C更换为它的同位素13C，拉曼位移就会产生100个波数的偏移，这两点预示了炔烃的衍生物极其适合抗干扰的多目标分析检测。但是，炔烃类信号分子的广泛应用却依然被自发拉曼散射信号强度很弱的问题严重限制，为了检测到极度微弱的炔基拉曼散射信号，人们不得不提高曝光时间或使用高强度激光，由此却又可能引起样品的损伤；近些年也有人尝试使用受激拉曼散射(StimulatedRamanscattering,SRS)技术进行相关研究，但昂贵的仪器价格让人们望而生畏的同时，其在多目标同时成像上的捉襟见肘也使其无法成为生物成像领域的通用仪器。结合近些年研究较多的SERS技术，它提供106～1012倍的信号增强，理论上将是一个改善炔基自发拉曼散射信号较弱的理想途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型炔烃编码、生物靶向的表面增强拉曼散射(Surface-enhancedRamanscattering,SERS)活性纳米标记探针的制备方法，更重要的是，发展一种亮度高、多色输出、光学稳定且无干扰的新型SERS成像技术。该技术(包括探针产品)可在常规的商品化共聚焦拉曼谱仪上实现广泛的生物成像应用；同时，亦能用于以带通滤光片为分光器件，以光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)为检测器件的无光栅超快拉曼成像仪的设计与开发。本专利技术提供的技术方案如下：一种无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，包括以下步骤：将拉曼散射峰位在1800-2400cm-1波数区、带宽为1-2nm的窄带单峰信号分子通过Au-S键或Ag-S键自组装到增强基底的表面，然后采用透光亲水的壳体材料进行探针封装，即得到无光学干扰的拉曼标记探针；所述的窄带单峰拉曼信号分子，具有通式I所示的结构：其中，R1、R2、R3、R4为-NO2、-CH3或H，R5为H或-Si(CH3)3、-C2H5、-CH2CH2CH2OH、苯基或炔基；所述的增强基底为粒径30-60nm的纳米粒子，所述的纳米粒子为(i)纳米金、(ii)纳米银或(iii)以纳米金或纳米银为壳的核壳结构纳米粒子；所述的壳体材料为生物分子、聚合物、二氧化硅中的一种。进一步地，R5为H的窄带单峰信号分子自组装到增强基底的表面后，用巯基羧酸对窄带单峰信号分子与增强基底的连接方式进行优化，接着采用透光亲水的壳体材料进行探针封装。再进一步地，将探针封装后在壳体材料上嫁接生物靶向分子。所述的窄带单峰拉曼信号分子为所述的巯基羧酸为巯基乙酸、巯基丙酸、巯基丁酸中的一种或几种；所述的生物靶向分子为抗体、配体、多肽中的一种。所述的抗体为促黄体激素释放激素，所述的配体为叶酸，所述的多肽为细胞穿透肽或核定位肽。所述的生物靶向分子通过与EDC-NHS或戊二醛交联反应嫁接到探针表面。一种无光学干扰的拉曼标记探针，由所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法制备得到。所述的无光学干扰的拉曼标记探针在生物成像中的应用。一种高灵敏超快拉曼成像仪，以所述的无光学干扰的拉曼标记探针为检测对象，在常规的光学显微镜基础上，以激光作为激发光源，配置高精度的快速扫描样品台，以超窄带带通滤光片提取探针的窄带单峰超强拉曼散射信号，以超灵敏的雪崩光电二极管为检测元件，通过样品台的二维扫描逐点采集探针的光子信号并作伪彩色处理。此快速、灵敏和高空间分辨拉曼成像仪器以带通滤光片的波长标定色差，以光子信号的强度标定色度。将所述的无光学干扰的拉曼标记探针对本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将拉曼散射峰位在1800‑2400cm‑1波数区、带宽为1‑2nm的窄带单峰信号分子通过Au‑S键或Ag‑S键自组装到增强基底的表面，然后采用透光亲水的壳体材料进行探针封装，即得到无光学干扰的拉曼标记探针；所述的窄带单峰拉曼信号分子，具有通式I所示的结构：其中，R1、R2、R3、R4为‑NO2、‑CH3或H，R5为H或‑Si(CH3)3、‑C2H5、‑CH2CH2CH2OH、苯基或炔基；所述的增强基底为粒径30‑60nm的纳米粒子，所述的纳米粒子为(i)纳米金、(ii)纳米银或(iii)以纳米金或纳米银为壳的核壳结构纳米粒子；所述的壳体材料为生物分子、聚合物、二氧化硅中的一种。
【技术特征摘要】
1.一种无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将拉曼散
射峰位在1800-2400cm-1波数区、带宽为1-2nm的窄带单峰信号分子通过Au-S键或Ag-S键自
组装到增强基底的表面，然后采用透光亲水的壳体材料进行探针封装，即得到无光学干扰
的拉曼标记探针；
所述的窄带单峰拉曼信号分子，具有通式I所示的结构：
其中，R1、R2、R3、R4为-NO2、-CH3或H，R5为H或-Si(CH3)3、-C2H5、-CH2CH2CH2OH、苯基或炔基；
所述的增强基底为粒径30-60nm的纳米粒子，所述的纳米粒子为(i)纳米金、(ii)纳米
银或(iii)以纳米金或纳米银为壳的核壳结构纳米粒子；
所述的壳体材料为生物分子、聚合物、二氧化硅中的一种。
2.根据权利要求1所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于：R5为H的
窄带单峰信号分子自组装到增强基底的表面后，用巯基羧酸对窄带单峰信号分子与增强基
底的连接方式进行优化，接着采用透光亲水的壳体材料进行探针封装。
3.根据权利要求1或2所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于：将
探针封装后在壳体材料上嫁接生物靶向分子。
4.根据权利要求3所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈爱国，陈勇，任家强，胡继明，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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