一株牛樟芝菌株及牛樟芝液态发酵方法技术

一种牛樟芝液态发酵方法，包括以下步骤：A、以牛樟芝菌株S-29为原料，先在麦芽汁斜面培养基上培养为樟芝斜面菌种；B、将樟芝斜面菌种接入液态种子培养基中培养为液态种子；C、将液态种子接种于液态发酵培养基中进行培养，在培养过程中添加过氧化氢，利用过氧化氢氧化胁迫诱导菌丝体合成安卓奎诺尔类化合物。本发明专利技术方法简单、高效，具有重要的工业应用价值，由于添加过氧化氢诱导牛樟芝液态发酵产生安卓奎诺尔及其衍生物，极大地缩减了牛樟芝液态菌丝体产品与其他形式培养物产品的功效差距。本发明专利技术方法生产的安卓奎诺尔及其衍生物可以应用于医药和保健食品领域。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种牛樟芝液态发酵方法，包括以下步骤：A、以牛樟芝菌株S-29为原料，先在麦芽汁斜面培养基上培养为樟芝斜面菌种；B、将樟芝斜面菌种接入液态种子培养基中培养为液态种子；C、将液态种子接种于液态发酵培养基中进行培养，在培养过程中添加过氧化氢，利用过氧化氢氧化胁迫诱导菌丝体合成安卓奎诺尔类化合物。本专利技术方法简单、高效，具有重要的工业应用价值，由于添加过氧化氢诱导牛樟芝液态发酵产生安卓奎诺尔及其衍生物，极大地缩减了牛樟芝液态菌丝体产品与其他形式培养物产品的功效差距。本专利技术方法生产的安卓奎诺尔及其衍生物可以应用于医药和保健食品领域。CGMCC No.959020140909【专利说明】
本专利技术涉及生物工程，特别涉及。 技术背景 高等药用真菌牛樟芝（Antrodia camphorata),又名牛樟燕，属于担子菌纲、多年 生担子菌，只生长在台湾地区的牛樟树腐朽树干的内壁。在民间，牛樟芝长久以来被用作解 酒保肝的传统药方，用于治疗肝脏疾病、食物和药物所引起的中毒症状，以及腹泻、腹痛、高 血压、皮肤发痒和肿瘤疾病等，又被称为灵芝之王、森林中的红宝石。近年来，许多学者研究 显示牛樟芝具有抗肿瘤、保肝、抗炎症、抗氧化、抗疲劳等多种活性功能，尤其在抗肿瘤和缓 解酒精性肝损伤方面。由于牛樟芝的功效卓越，市场上对其子实体的需求也越来越高，然而 其野生子实体生长非常缓慢，并且唯一寄主牛樟树十分稀缺，使得野生牛樟芝子实体价格 一路飙升，高达15000-20000美元/公斤，远高于灵芝、人参、冬虫夏草等传统药材，极具开 发前景。 牛樟芝菌丝体中药理活性开发最深入的是安卓奎诺尔及其衍生物，属于泛醌类化 合物，包括 Antroquinonol、Antroquinonol B 和 4-acetyl-Antroquinonol B 等，只在固态 发酵菌丝体中可以合成，而在液态发酵菌体中不能合成。牛樟芝安卓奎诺尔类化合物具有 良好的抗癌活性。Lee等人利用正己烧从牛樟芝固态发酵培养物中分离出Antroquinonol， 结果表明Antroquinonol对MCF-7和MDA-MB-231 (人乳腺癌细胞）、Ifep3B和IfepG2 (人 肝癌细胞）、DU-145和LNCaP(人前列腺癌细胞）等多种癌细胞具有良好的杀灭效果， 同时具有抑制HBsAg和HBeAg合成的潜力，从而抑制HBV的复制。Kumar等人研究显示 Antroquinonol对A549 (腺癌细胞系）具有强烈的抑制作用，使用12h后其EC50 = 25 y M ; 同时，Antroquinonol可以通过改变PI3K/mT0R蛋白活性和mRNA的表达，显著的抑制三种 NSCLS癌细胞的增殖。目前，牛樟芝的人工培养方式主要有三种：牛樟树椴木栽培或是太空包法获得子 实体、利用谷物固态发酵法获得菌丝体培养物以及深层液态发酵法获得菌丝体培养物。虽 然菌丝体中很少含有子实体标志的麦角留烷类三萜化合物，但是其自身含有的特征活性成 分（如Antrodins、安卓奎诺尔等）赋予了菌丝体非常良好的保肝和抗癌等活性功能，同时 还产生了一些新的活性，包括神经保护、调节免疫、降血脂等，这使得菌丝体培养物在牛樟 芝资源开发中占有较为有利的地位。与固态发酵相比，深层液态发酵法是快速获得大量菌 丝体产品最有效的途径，可以快速的形成较大生产规模。但是牛樟芝深层液态发酵的缺点 也非常明显，其中最大的就是活性产物的种类及产量较低一与固态发酵相比，正常发酵状 态下活性产物种类较为少，几乎不产安卓奎诺尔类化合物，这就使得牛樟芝液态发酵菌丝 体产品的功效较弱，市场竞争力不强。 公开号为CN1456661A (专利技术名称：樟芝大规模液体深层发酵生产工艺）、 CN101803528A(-种樟芝菌丝体的新颖培养方法）等专利文献公开了一系列的通过发酵 法生产樟芝的细胞培养方法，但上述文献中所公开的细胞培养产物均为樟芝菌丝体或是多 糖，并没有关于樟芝菌丝体特征活性产物安卓奎诺尔类化合物的生产方法报道。 由于富含生理活性物质的樟芝产品的需求与日倶增，急需一种有效的牛樟芝液态 发酵方法，有针对性地提高牛樟芝菌体特征活性产物安卓奎诺尔类化合物的含量，以提高 牛樟芝液态发酵菌丝体产品的功效，满足市场的不断更新发展。
技术实现思路
本专利技术的目的，就是针对现有技术中存在的问题，提供一株牛樟芝菌株及牛樟芝 液态发酵方法，可以提高牛樟芝菌丝体中安卓奎诺尔类化合物的产量。 本专利技术中的牛樟芝菌株S-29,己于2014年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为樟芝，拉丁 文分类命名为Antrodia camphorata，保藏编号为CGMCC No 9590。上述牛棒芝菌株S-29 的序列如SEQ ID NO. 1所示。 基于上述牛樟芝菌株的牛樟芝液态发酵方法，包括以下步骤： A、以牛樟芝菌株S-29为原料，先在麦芽汁斜面培养基上培养为樟芝斜面菌种； B、将樟芝斜面菌种接入液态种子培养基中培养为液态种子； C、将液态种子接种于液态发酵培养基中进行培养，在培养过程中添加过氧化氢， 利用过氧化氢氧化胁迫诱导菌丝体合成安卓奎诺尔类化合物。 步骤A的培养时间为10-12天，培养温度为28°C。 步骤B的培养时间为2天，培养温度为30°C。 步骤C的培养时间为5-20天，培养温度为28°C，过氧化氢在培养至少一天后添加， 添加过氧化氢后再至少培养四天，过氧化氢添加量为5-100mm 〇l/L。 步骤C中液态种子的接种量为5 % -50 % (v/v)。 所述液态发酵培养基包括碳源、氮源以及一种以上的无机盐；所述碳源为可溶 性淀粉、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、糯米粉或其组合；所述氮源为NH 4C1、胰蛋白胨、黄豆粉、玉 米浆粉、麦芽抽提物、酵母抽提物或其组合；所述无机盐为磷酸盐、硫酸镁、柠檬酸盐、氯化 钠或其组合；碳源的添加量为20-100g/L ;氮源的添加量为2-15g/L ;无机盐的添加量为 0. 1-1. Og/L ;液态发酵培养基配制完成后于121°C灭菌10_40min，然后冷却至15-35°C待 用。 本专利技术的方法能诱导牛樟芝液态发酵菌丝体产生安卓奎诺尔类化合物。在发酵过 程中添加过氧化氢进行氧化胁迫，促进液态发酵菌体产生具有良好抗癌功效的活性产物， 其中安卓奎诺尔含量为7-15mg/g菌体，安卓奎诺尔B含量为20-50mg/g菌体。本专利技术的发 酵方法技术工艺简单、高效，有着重要的工业应用价值，同时对促进牛樟芝其他活性代谢产 物的生产具有一定的启迪意义。 安卓奎诺尔、安卓奎诺尔B等化合物采用高效液相色谱法（HPLC)进行分析。取 烘干粉碎的牛樟芝液态发酵菌粉末〇. 5g，加入60ml乙醇，50°C，振荡萃取1. 5h，静置后取 上清经过0. 22 ym滤膜微滤，进行HPLC分析。分析条件如下：色谱柱：Sepax Amethyst C18(4. 6mmX250mm);流速：lmL/min ;检测波长：254nm ;流动相 A :水 / 乙酸=100/0. 5， 流动相B :乙腈；洗脱梯度如下：0-10min，流动相B 35 % -50 % ; 10-35m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)，命名为牛樟芝菌株S‑29，其保藏编号为CGMCC No 9590。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：夏永军，艾连中，许赣荣，王光强，杨昳津，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31