促虫草菌高效代谢合成抗肿瘤化合物jiangxienone的方法技术

本发明专利技术公开了一种促虫草菌高效代谢合成抗肿瘤化合物jiangxienone的方法。本发明专利技术将通过添加亚铁离子来调控虫草菌高效发酵代谢合成抗肿瘤化合物jiangxienone，它能够有效提高江西虫草菌发酵代谢合成jiangxienone的效率，产量由1.0μg/g干菌丝体提高到221.26±6.79 g/g干菌丝体，极大提高了其产量。且该方法简单，易于操作，极其适合虫草菌液体深层发酵生产jiangxienone，对规模化生产jiangxienone及其成药性研究，都具有重要的理论意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种。本专利技术将通过添加亚铁离子来调控虫草菌高效发酵代谢合成抗肿瘤化合物jiangxienone，它能够有效提高江西虫草菌发酵代谢合成jiangxienone的效率，产量由1.0μg/g干菌丝体提高到221.26±6.79 g/g干菌丝体，极大提高了其产量。且该方法简单，易于操作，极其适合虫草菌液体深层发酵生产jiangxienone，对规模化生产jiangxienone及其成药性研究，都具有重要的理论意义和应用价值。CGMCC No.972020141014【专利说明】促虫草菌高效代谢合成抗肿瘤化合物j iangxienone的方 法
本专利技术涉及制药领域，特别是一种促虫草菌高效代谢合成抗肿瘤化合物 jiangxienone 的方法。
技术介绍
虫草菌是一类特殊类型真菌资源。在长期的进化过程中，为克服入侵时寄主的天 然屏障，以及逃避侵入后寄主的免疫监控，达成与寄主的生活史同步化，最终完成自身细胞 增殖、分化和整个生活史。在这个过程，生成了与细胞信号传导、应激保护相关的，具有化 学结构多样、生物功能多样和作用多靶点等特点的活性次生代谢产物，展示出巨大创制新 药的潜力。现有的研究结果提示，在虫草菌中已发现丰富多样的抗肿瘤活性次生代谢产物 (Recent Patents on Biotechnology, 1 (2):123-137, 2007; Advance in Biochemical Engineering & Biotechnology, 113: 79-150, 2009)〇 江西虫草菌Coroyce/w Jiangxi为虫草菌一个新种，在民间俗称"草木王"， 是治疗毒蛇咬伤的良药（Mycosystema, 20: 306-309，2003)。我们在虫草菌抗肿瘤药物筛 选过程，从江西虫草菌发酵菌丝体中筛选到一种新骨架化合物，命名为jiangxienone (江 西烯酮脂）。该化合物对人源性肺癌、胃癌、白血病、肝癌、结肠癌等不同来源的肿瘤细胞株 呈不同程度的细胞毒效应，尤其是对胃癌细胞株显著的细胞毒作用，是临床一线抗癌药物 顺铂的6倍，但对人源性正常细胞和小鼠骨髓基质细胞克隆无影响（ZL 201010159145. 8 ; Chemistry & Biodiversity, 9(7): 1349-1355, 2012 ；Process Biochemistry, 49(4): 697-705，2014)。进一步研究结果提示，其抑制肿瘤细胞生长的作用机制涉及DNA损伤响 应途径，jiangxienone可嵌入肿瘤细胞DNA分子并引起其双链断裂，从而发挥抗肿瘤生长 的细胞毒效应（Process Biochemistry, 49(4): 697-705，2014)。因此，jiangxienone 具 有成为抗肿瘤新药先导化合物的潜力，亟待进一步对其展开成药性及临床前的研究。而这 些研发工作的开展亟需大量的jiangxienone样品。正常条件下，真菌等微生物代谢合成 的次生代谢产物产量甚微，jiangxienone在江西虫草中的含量仅为1.0 yg/g干菌丝体， 使得对其后续药理、药学方面的研究工作难以为继。因此，亟需提高江西虫草菌代谢合成 jiangxienone产量，为后续研发提供物质保障。 自上世纪40年代，采用液体深层发酵让产黄青霉生产青霉素以来，真菌液体深层 发酵技术日臻成熟。但具体到生产菌株，影响其代谢合成目标产物的因素及其复杂。通常 可归为两大类，一是通过发酵策略来提升目标产物的产量；二是基于目标产物的生源途径， 采用分子工程手段改造菌株，提高产量。改变发酵策略是最常见，也是最有效的方法，其涉 及面广，从菌种目标产物发酵生产所要求的培养基成分(碳源、氮源、无机盐、生长因子)、前 体物、消泡剂、温度、酸碱度、溶氧、接种量等环境因子到发酵物理参数调控，包括剪切力（搅 拌转速)、补料培养(碳源、氮源或前体)、两阶段培养等。 细胞代谢活动过程异常复杂，这个过程也是成百上千种酶在内外源信号干预下稳 定有序进行调节反应。金属离子在这个过程中常扮演重要角色，是酶的辅基或激活剂。有 些金属离子是酶蛋白活性中心的重要组成部分或必要构件；有些酶需要金属离子激活；有 些过渡态金属通过自身化合价的变化传递电子，参与体内的氧化还原过程。因此，在真菌 发酵过程中添加金属离子有可能影响细胞的代谢状态，进而有利于目标产物代谢合成。已 有文献报道，通过添加某些金属离子或金属盐，对真菌次生代谢产物的合成途径进行调节， 从而使其发酵产量提高。譬如，Jia等添加镁离子提高了抗癌药物安丝菌素P-3的产量 (Bioresource Technology, 102(21): 10147-10150，2011) ;Xu 等研究发现，|丐离子和钠 离子能有效提高灵芝菌代谢合成灵芝酸（Biotechnology Advances, 30(6): 1301-1308， 2011; Biotechnology and Bioengineering 110(7): 1913-1923, 2013)〇
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种促虫草菌高效代谢合成抗肿瘤化合物 jiangxienone的方法及其应用，它够有效提高江西虫草菌发酵代谢合成jiangxienone效 率。 本专利技术是这样实现的：促虫草菌高效代谢合成抗肿瘤化合物jiangxienone的方 法，包括如下步骤： 1)江西虫草菌接种于斜面，在24_28°C下培养7-15天，在4°C下保存备用；斜面种 子培养基的组成按质量百分比计算，包括葡萄糖1-4%、麦麸0. 1-1%、蛋白胨0. 1-1%、酵 母粉0. 1-1 %、磷酸二氢钾0.05-0. 15%、七水硫酸镁0.01-0. 05%及琼脂1.8%，总量满足 100%，初始pH为7 ; 2) 用接种针挑取0. 5-lcm2斜面菌种块接种于摇瓶中，在温度为24-28 °C，转速为 120-200rpm的条件下，摇床培养4-7天；摇床中的液体种子培养基的装液量体积百分 比为30-60%，液体种子培养基的组成按质量百分比计算：包括葡萄糖1-4%、蛋白胨 0. 1-1%、酵母粉0. 1-1%、七水硫酸镁0.01-0. 05%及磷酸二氢钾0.05-0. 15%，磷酸氢二 钾0.05-0. 15 %，总量满足100 %，初始pH为7 ; 3) 另取一个新的摇瓶，在新的摇瓶中加入发酵培养基，装液量体积百分比为40-70%， 再将步骤2)中培养获得的种子培养液，按体积百分比为3-5%的接种量接种于发酵培养基 中，在转速为120_200rpm，温度为25-30°C的条件下，避光培养7-21天，获得成品；培养过程 中添加经0. 22 ym微孔滤膜过滤除菌的亚铁离子（培养的整个过程都可以添加亚铁离子， 但添加时间不同其促进jiangxienone产量增加的效果不同，实验证明发酵第8天添加亚铁 离子促进jiangxienone产量增加的效果最为明显，优于配制培养基时添加），添加后亚铁 离子的浓度为〇. l-l〇〇mM ;发酵培养基的组成按质量百分比计算，包括蔗糖1-4%、硝酸钠 0? 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促虫草菌高效代谢合成抗肿瘤化合物jiangxienone的方法，其特征在于：包括如下步骤：1）江西虫草菌接种于斜面，在24‑28℃下培养7‑15天，在4 ℃下保存备用；斜面种子培养基的组成按质量百分比计算，包括葡萄糖 1‑4%、麦麸0.1‑1%、蛋白胨0.1‑1%、酵母粉0.1‑1%、磷酸二氢钾0.05‑0.15%、七水硫酸镁 0.01‑0.05%及琼脂1.8%，总量满足100%，初始pH为7；2）用接种针挑取0.5‑1 cm2斜面菌种块接种于摇瓶中，在温度为24‑28℃，转速为120‑200 rpm的条件下，摇床培养4‑7天；摇床中的液体种子培养基的装液量体积百分比为30‑60%，液体种子培养基的组成按质量百分比计算：包括葡萄糖1‑4%、蛋白胨0.1‑1%、酵母粉0.1‑1%、七水硫酸镁0.01‑0.05%及磷酸二氢钾0.05‑0.15%，磷酸氢二钾0.05‑0.15%，总量满足100%，初始pH为7；3）另取一个新的摇瓶，在新的摇瓶中加入发酵培养基，装液量体积百分比为40‑70%，再将步骤2）中培养获得的种子培养液，按体积百分比为3‑5%的接种量接种于发酵培养基中，在转速为120‑200rpm，温度为25‑30℃的条件下，获得成品；培养过程中添加经0.22微孔滤膜过滤除菌的亚铁离子，添加后亚铁离子的浓度为0.1‑100 mM，避光培养7‑21天即可；发酵培养基的组成按质量百分比计算，包括蔗糖1‑4%、硝酸钠0.1‑0.5%、磷酸氢二钾0.05‑0.15%，七水硫酸镁0.01‑0.05%，氯化钾0.01‑0.05%，初始pH为7。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建辉，钟建江，刘如明，刘元元，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52