一种利用高粱花叶病毒P3N‑PIPO构建的亚细胞定位试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种利用高粱花叶病毒P3N‑PIPO构建的植物亚细胞定位试剂盒，包括4个分别标记绿色、红色、黄色和青色荧光蛋白的胞间连丝定位载体：SrMV‑P3N‑PIPO‑GFP、pSrMV‑P3N‑PIPO‑RFP、pSrMV‑P3N‑PIPO‑YFP和pSrMV‑P3N‑PIPO‑CFP；4个无特异亚细胞定位的对照载体：pSAT6‑EGFP‑C1、pSAT6‑ERFP‑C1、pSAT6‑EYFP‑C1和pSAT6‑ECFP‑C1；限制性内切酶Xho I、Hind III、无RNase水和侵染液。使用本试剂盒可以快速明确目的基因表达产物是否具有胞间连丝定位的特性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种试剂盒，具体涉及一种利用高粱花叶病毒P3N-PIPO构建的亚细胞定位试剂盒。本专利技术利用分别带有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)标记、红色荧光蛋白(redfluorescentprotein,RFP)、黄色荧光蛋白(yellowfluorescentprotein,YFP)和青色荧光蛋白(cyanfluorescentprotein,CFP)的具有特异胞间连丝(Plasmodesma,PD)定位功能的蛋白SrMV-P3N-PIPO，指示待验证基因表达蛋白是否具有胞间连丝定位的特性，属于生物

技术介绍
随着生物技术的发展，尤其是基因组学的发展和测序技术的进步，越来越多的新基因被发现，已经形成了海量数据。明确未知基因的功能，探讨其潜在的应用价值，是基因组学研究的终极目标。蛋白质是基因的表达产物，蛋白质的亚细胞定位与蛋白质的结构和功能关系密切，蛋白质必须处于合适的位置才能发挥其功能。对于一个新基因，明确其表达产物即蛋白质的亚细胞定位，可以为研究该基因的功能提供重要线索。目前，确定蛋白质亚细胞定位的方法主要有三种：细胞分馏法，电子显微镜分析，激光共聚焦法，其中激光共聚焦法应用最为广泛。激光共聚焦法利用标记荧光蛋白受激发产生的荧光信号，可以直观的观察到目标蛋白所在的亚细胞位置。在对目标蛋白的亚细胞定位进行研究时，需要阳性对照，即具有特异亚细胞地位的带有可检测标记的蛋白，佐证未知蛋白的定位。胞间连丝(Plasmodesma,PD)是植物体内穿过细胞壁连接相邻细胞的细胞质和内质网的连丝微管，是细胞间物质运输与信息传递的重要通道。PD的结构极其复杂，至今依然没有完全清楚，其结构模型一直处于补充更新状态。PD的通透性受多种因素调节，小分子物质可以通过胞间连丝自由扩散，但是蛋白质、核酸等大分子或者大分子复合体如病毒粒子、核糖体蛋白复合体等的胞间移动受PD的调控。对于植物胞间信号传导和物质运输等方面的研究而言，尽管可以利用生物信息学手段对分离到的基因的编码蛋白亚细胞定位进行预测，但是必须对该基因编码蛋白做亚细胞定位进行生物学实验，明确其能否定位于PD，进而判定该蛋白是否参与胞间信号转导和物质运输，为研究其功能提供直观的实验证据。2008年，Chung等利用生物信息学方法，对包括甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus,SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus,SCSMV)等在内的48个马铃薯Y病毒科的病毒分析表明，在P3基因内部存在一个保守结构G1-2A6-7，核糖体在该保守结构通过+2移码可以翻译出一个大约6-7kDa的蛋白(PIPO)，该蛋白与P3蛋白的N端结合，形成一个大约25kDa的融合蛋白，即P3N-PIPO。Chung等克隆了芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus,TuMV)的P3N-PIPO编码序列，并通过实验证实了TuMV-P3N-PIPO定位于胞间连丝。研究表明，P3N-PIPO很可能是马铃薯Y病毒的移动蛋白，该蛋白通过与寄主因子互作，使病毒通过胞间连丝实现胞间移动，进而对寄主建立系统性侵染(Choi等,2005；Chung等,2008；Wen等,2010；Wei等,2010；Vijayapalani等,2012)。但是有关SCMV-P3N-PIPO，SrMV-P3N-PIPO和SCSMV-P3N-PIPO的亚细胞定位研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用高粱花叶病毒P3N-PIPO构建的亚细胞定位试剂盒，为检测目的基因表达产物是否定位于植物胞间连丝提供指示。为实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下。利用融合PCR技术，以SrMV的P3基因编码序列为模板，克隆了P3N-PIPO的编码序列，构建到携带不同荧光标记蛋白基因植物表达载体上，转化农杆菌，注射本氏烟叶片，在激光共聚焦显微镜下使用相应的激光激发并采集发射光信号，即可在本氏烟上皮细胞的胞间连丝位置上观测到清晰明亮的点状图像，证明了P3N-PIPO定位于胞间连丝。据此，我们利用SrMV的P3N-PIPO构建了植物亚细胞定位试剂盒。本专利技术的一种利用高粱花叶病毒P3N-PIPO构建的亚细胞定位试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成：(1)绿色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIPO-GFP，作为阳性对照，1管，100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；(2)红色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIPO-RFP，作为阳性对照，1管，100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；(3)黄色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIPO-YFP，作为阳性对照，1管，100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；(4)青色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIPO-CFP，作为阳性对照，1管，100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；(5)载体pSAT6-EGFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；(6)载体pSAT6-ERFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；(7)载体pSAT6-EYFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；(8)载体pSAT6-ECFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；(9)限制性内切酶XhoI：1管，500units，100μL/管，-20℃冷冻保存备用；(10)限制性内切酶HindIII：1管，500units，100μL/管，-20℃冷冻保存备用；(11)无RNase水：2瓶，100mL/瓶，4℃冷藏保存备用；(12)侵染液：1管，50mL/管，-20℃冷冻保存备用；所述侵染液，包括D-葡萄糖，250mg；MES，5mL；Na3PO4·12H2O，5mL；乙酰丁香酮，5μL；加入ddH2O至总体积50mL。所述绿色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIPO-GFP的构建方法：使用XhoI和HindIII对载体pSAT6-EGFP-C1(GenBank:AY818374)进行双酶切，然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并转化至感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中，挑取阳性克隆验证；所述红色荧光蛋白标记的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用高粱花叶病毒P3N‑PIPO构建的亚细胞定位试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成：(1)绿色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV‑P3N‑PIPO‑GFP，作为阳性对照，1管，100ng/μL，50μL/管，‑20℃冷冻保存备用；(2)红色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV‑P3N‑PIPO‑RFP，作为阳性对照，1管，100ng/μL，50μL/管，‑20℃冷冻保存备用；(3)黄色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV‑P3N‑PIPO‑YFP，作为阳性对照，1管，100ng/μL，50μL/管，‑20℃冷冻保存备用；(4)青色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV‑P3N‑PIPO‑CFP，作为阳性对照，1管，100ng/μL，50μL/管，‑20℃冷冻保存备用；(5)载体pSAT6‑EGFP‑C1，1管，500ng/μL，50μL/管，‑20℃冷冻保存备用；(6)载体pSAT6‑ERFP‑C1，1管，500ng/μL，50μL/管，‑20℃冷冻保存备用；(7)载体pSAT6‑EYFP‑C1，1管，500ng/μL，50μL/管，‑20℃冷冻保存备用；(8)载体pSAT6‑ECFP‑C1，1管，500ng/μL，50μL/管，‑20℃冷冻保存备用；(9)限制性内切酶Xho I：1管，500units，100μL/管；(10)限制性内切酶Hind III：1管，500units，100μL/管；(11)无RNase水：2瓶，100mL/瓶；(12)侵染液：1管，50mL/管，‑20℃冷冻保存备用。...

【技术特征摘要】
1.一种利用高粱花叶病毒P3N-PIPO构建的亚细胞定位试剂盒，其特征在于该试剂盒由
下列试剂组成：
(1)绿色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIPO-GFP，作为阳性对照，1管，
100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；
(2)红色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIPO-RFP，作为阳性对照，1管，
100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；
(3)黄色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIPO-YFP，作为阳性对照，1管，
100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；
(4)青色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIPO-CFP，作为阳性对照，1管，
100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；
(5)载体pSAT6-EGFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；
(6)载体pSAT6-ERFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；
(7)载体pSAT6-EYFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；
(8)载体pSAT6-ECFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；
(9)限制性内切酶XhoI：1管，500units，100μL/管；
(10)限制性内切酶HindIII：1管，500units，100μL/管；
(11)无RNase水：2瓶，100mL/瓶；
(12)侵染液：1管，50mL/管，-20℃冷冻保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种利用高粱花叶病毒P3N-PIPO构建的亚细胞定位试剂盒，
其特征在于所述绿色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIPO-GFP的构建方法：使用
XhoI和HindIII对载体pSAT6-EGFP-C1进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分
离并回收；然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接产物转化至感受
态大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中，挑取阳性克隆验证，得到绿色...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永庆，程光远，彭磊，徐倩，董萌，徐景升，翟玉山，邓宇晴，郑艳茹，高世武，郭晋隆，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35