一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种裸鼹鼠星形胶质细胞的分离纯化和培养方法。本发明专利技术综合使用多种培养基从新生裸鼹鼠大脑皮层分离并纯化培养星形胶质细胞，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠星形胶质细胞的合理培养方法。本发明专利技术方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠星形胶质细胞，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠星形胶质细胞的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及细胞生物学
，具体涉及一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠星形胶质细胞的分离纯化和培养方法。
技术介绍
：星形胶质细胞(Astrocyte)是哺乳动物中枢神经系统中比例最高的一类细胞。随着越来越多的研究发现星形胶质细胞在突触形成、突触信号传递效率，以及突触可塑性中发挥作用，星形胶质细胞逐渐开始引起了科研人员更多的关注。裸鼹鼠是一种变温哺乳动物，在氧气浓度仅有6％左右的不通风洞穴中能够保持脑结构和功能的完整无损并进行正常的生命活动。而研究发现星形胶质细胞常常会伸出伪足贴附在脑内毛细血管周围，以随时密切感受来自血管中氧浓度、以及离子环境的变化，并及时作出相应的反应，例如分泌神经营养因子或免疫相关因子等由于在体微环境非常复杂，无法在体直接观察星形胶质细胞在低氧环境中的功能改变情况及其适应机制，并且在体的结果可能容易受到微环境中其他细胞组分和结构的影响(Astrocyte-mediatedischemictolerance.YuriHirayama,YuriIkeda-Matsuo,ShojiNotomi,HiroshiEnaida,HiroyukiKinouchi,andSchuichiKoizumi.JNeurosci.2015Mar4；35(9):3794-805.)。因此需要建立离体的裸鼹鼠星形胶质细胞模型以弥补在体观察的缺陷。目前，研究人员已经建立出大鼠及小鼠星形胶质细胞的培养方法(YanGu,MulanHe,XiaoqinZhou,JinngjingLiu,NaliHou,TanBin,YunZhang,TingyuLiandJieChen.EndogenousIL-6ofmesenchymalstemcellimprovesbehavioraloutcomeofhypoxic-ischemicbraindamageneonatalratsbysupressingapoptosisinastrocyte.SciRep.2016Jan14；6:18587.doi:10.1038/srep18587.)。中国专利申请CN201210223545.X，申请公布号为CN102703387A，公开了一种SD乳鼠星形胶质细胞的分离和培养方法，包括大脑皮质组织分离、组织细胞捣碎后筛网过滤、细胞原代培养、细胞传代培养4个实验步骤；其中细胞原代培养所用培养基为DMEM培养液和终浓度为20％的小牛血清；其中细胞传代培养所用培养基为DMEM培养基和终浓度为10％的小牛血清。但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的星形胶质细胞分离纯化和培养方法均不适用于裸鼹鼠，目前国内外文献尚无有关裸鼹鼠星形胶质细胞分离纯化和培养方法的相关报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种裸鼹鼠星形胶质细胞的分离纯化和培养方法，以方便、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠星形胶质细胞，为体外建立裸鼹鼠星形胶质细胞提供技术支持，同时为体外研究裸鼹鼠星形胶质细胞的活化、以及低氧耐受能力、以及裸鼹鼠星形胶质细胞低氧耐受机制的阐述和相应治疗药物或靶分子的筛选提供强大的保障。我们试用了目前小鼠、大鼠的星形胶质细胞分离纯化和培养方法，结果发现均无法培养获得纯度高、状态好的裸鼹鼠星形胶质细胞，而且裸鼹鼠星形胶质细胞增殖的数量也较少。关于裸鼹鼠星形胶质细胞的培养尚没有建立出可行的实验方法，我们分析其原因，主要是：1)裸鼹鼠是一种变温动物，其体细胞离体培养的温度有待摸索，并且其不恒定的机体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼹鼠生存在较为阴暗潮湿的环境中，其体细胞的培养对湿度有较高的要求；3)裸鼹鼠已经适应了外界低氧的环境，所以其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸索。因此，裸鼹鼠星形胶质细胞的培养中最重要的摸索到合适的温度、湿度和氧气浓度，以及摸索到适合的培养基。为达到此目的，本专利技术的裸鼹鼠星形胶质细胞的分离纯化方法包括以下步骤：A、收集裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞：分离出生1-9天裸鼹鼠大脑皮层组织，将组织剪碎，加入组织消化液混匀之后，于37℃中消化30-40min；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞混合培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；随后将单细胞悬液种于无菌培养瓶中；所述的组织消化液，可以为常规的蛋白水解酶类消化液，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，辅以DNA酶I以解除DNA片段粘连所致的细胞聚集。优选的组织消化液：含有0.25％胰酶和终浓度为0.4mg/mlDNA酶I的混合液。所述的混合神经细胞培养基，可以为常规的含血清混合神经细胞培养液，例如低糖DMEM等。优选的混合神经细胞培养基为含有10％胎牛血清的低糖DMEM。B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中培养25--40天；自混合神经细胞接种之后，每7天采取半量换液的方法更换混合神经细胞培养基。C、裸鼹鼠星形胶质细胞的分离及纯化培养：将步骤B培养的混合神经细胞恒温震荡培养，恒温35±2℃，然后将上清丢弃，并将剩余贴于培养瓶底部的细胞用胰酶消化，混合神经细胞培养基终止消化，随后离心后保留沉淀并用星形胶质细胞培养基重悬并吹打成单细胞悬液并种于未包被左旋多聚赖氨酸的培养皿中。所述的星形胶质细胞培养基，为添加无血清营养因子的Neurobasal培养基等，优选为添加体积分数为2％N2的Neurobasal。所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。进一步，步骤A中，取出生1-9天裸鼹鼠大脑，剥除脑膜后分离皮层组织，用显微剪将组织剪碎至1mm3，加入组织消化液混匀之后，于37℃中消化35min。然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在神经细胞混合培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液。随后将单细胞悬液种于无菌T25培养瓶中。进一步，步骤A中，所述组织消化液为含有0.25％胰酶(质量体积分数)和终浓度为0.4mg/mlDNA酶I的混合液，消化时间为35分钟。进一步，步骤B中，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中培养35天。进一步，步骤B中，所述三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法，包括以下步骤：A、收集裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞：分离出生1‑9天裸鼹鼠大脑皮层组织，将组织剪碎，加入组织消化液混匀之后，于37℃中消化30‑40min；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞混合培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；随后将单细胞悬液种于无菌培养瓶中；B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中培养25‑‑40天；自混合神经细胞接种之后，每7天采取半量换液的方法更换混合神经细胞培养基；C、裸鼹鼠星形胶质细胞的分离及纯化培养：将步骤B培养的混合神经细胞恒温震荡培养，恒温35±2℃，然后将上清丢弃，并将剩余贴于培养瓶底部的细胞用胰酶消化，混合神经细胞培养基终止消化，随后离心后保留沉淀并用星形胶质细胞培养基重悬并吹打成单细胞悬液并种于未包被左旋多聚赖氨酸的培养皿中。所述的星形胶质细胞培养基为添加体积分数为2％N2的Neurobasal；所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。

【技术特征摘要】
1.一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法，包括以下步骤：
A、收集裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞：
分离出生1-9天裸鼹鼠大脑皮层组织，将组织剪碎，加入组织消化液混
匀之后，于37℃中消化30-40min；然后用混合神经细胞培养基终止消化，
离心去除上清之后，在混合神经细胞混合培养基中将沉淀重悬并吹打成单
细胞悬液；随后将单细胞悬液种于无菌培养瓶中；
B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：
将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基中培养于三气
培养箱中培养25--40天；自混合神经细胞接种之后，每7天采取半量换液
的方法更换混合神经细胞培养基；
C、裸鼹鼠星形胶质细胞的分离及纯化培养：
将步骤B培养的混合神经细胞恒温震荡培养，恒温35±2℃，然后将上
清丢弃，并将剩余贴于培养瓶底部的细胞用胰酶消化，混合神经细胞培养
基终止消化，随后离心后保留沉淀并用星形胶质细胞培养基重悬并吹打成
单细胞悬液并种于未包被左旋多聚赖氨酸的培养皿中。
所述的星形胶质细胞培养基为添加体积分数为2％N2的Neurobasal；
所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，
二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。
2.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法，其特征在于，
步骤A中，所述的组织消化液为浓度为0.25％质量浓度的胰酶和浓度为
0.4mg/mlDNA酶I的混合液。
3.根据权利要求1所述的一种裸鼹...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔淑芳，杨文静，孙伟，汤球，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31