用于培养可分化细胞的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及一种用于培养可分化细胞的组合物和方法。本发明专利技术涉及基本上不含血清而含有基础盐养分溶液和ErbB3配体的细胞培养方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2007年2月23日、申请号为200780010554.8、发明名称为“用于培养可分化细胞的组合物和方法”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交互参考本申请要求享有于2006年2月23日提交的美国序号60/776,113的优先权，在此引入作为参考。关于联邦政府资助研发的声明在本专利技术进展期间完成的部分工作使用了国立卫生研究院基金第5R24RR021313-05号的美国政府基金。美国政府在本专利技术中享有一定的权利。专利技术背景专利
本专利技术涉及细胞培养方法和组合物，其中基本不含血清，而含有基础盐养分溶液和ErbB3配体。专利技术背景人类多能细胞为研究人类发育早期阶段以及某些疾病如糖尿病和帕金森病的治疗性干预提供了独特的机会。例如，使用来源于人类胚胎干细胞(hESC)的可生成胰岛素的β细胞比现有的利用供体胰腺细胞的细胞疗法具有很大的改进。如今治疗糖尿病的细胞疗法使用的是来自供体胰腺的细胞，此方法因缺乏移植所需的高质量胰岛细胞而受限。对一位I型糖尿病患者使用的细胞疗法就需要移植大约8×108个胰岛细胞(Shapiro等人,2000,NEnglJMed343:230-238；Shapiro等人,2001a,BestPractResClinEndocrinolMetab15:241-264；Shapiro等人,2001,BritishMedicalJournal322:861)。因此，为了获得成功移植所需的足够的胰岛细胞，至少需要两名健康供者的器官。因此，胚胎干细胞(ES细胞)代表着用于研究早期胚胎内多能细胞生物学及分化机理的有效的模型系统，以及为哺乳动物的遗传操作及其所带来的商业、医学和农业上的应用提供机会。另外，适当的ES细胞增殖和分化也能够潜在地用于产生适合移植治疗因细胞损伤或功能障碍所致疾病的无限的细胞资源。其他多能细胞和细胞系，包括如国际专利申请WO99/53021中所述的早期原始外胚层样(EPL)细胞、体内或体外衍生的ICM/上胚层、体内或体外衍生的原始外胚层、原生殖细胞(EG细胞)、畸胎癌细胞(EC细胞)、以及经去分化或核移植衍生的多能细胞，也共有着部分或全部的这些性质和应用性。国际专利申请WO97/32033以及专利号为5,453,357的美国专利都介绍了多能细胞，包括来源于非啮齿类物种的细胞。国际专利申请WO00/27995以及专利号为6,200,806的美国专利介绍了人类ES细胞，国际专利申请WO98/43679介绍了人类EG细胞。调节ES细胞多能性和分化的生物化学机制还不清楚。然而，可以获得的有限的经验数据(以及非常不确定的证据)提示，在体外培养条件下多能胚胎干细胞的持续维持依赖于胞外环境中细胞因子和生长因子的存在.人类胚胎干细胞为获得大量用于人类细胞疗法的高质量分化细胞提供了原材料的来源，但是这些细胞必须在那些与临床安全性和有效性管理规范相符合的条件中获得和/或培养。这些规范很可能会要求使用化学成分确定的培养基。开发此种化学成分确定的/GMP标准的条件，对于促进hESC和hESC衍生的细胞在人类治疗用途中的应用是必不可少的。此外，基于hESC的细胞替代疗法的最终应用会要求开发那些能确保符合管理规范的大规模培养和分化条件的方法。尽管有些小组已经报告了简化的hESC生长条件，但这些研究还有着重大的限制。然而迄今为止。多能细胞的成功分离、长期克隆维持、遗传操作以及种系传递都普遍有难度。大多数干细胞培养条件仍在培养基中包含血清替代物(KSR)(Xu等人,2005StemCells,23:315-323；Xu等人,2005NatureMethods,2:185-189；Beattie等人.,2005StemCells,23:489-495；Amit等人.,2004Biol.Reprod.,70:837-845；James等人.,2005Development,132:1279-1282)。KSR包含牛血清白蛋白(BSA)的粗组分而非高度纯化的来源。其他人都只进行了短期的研究，因此还不清楚他们的条件能否长时间保持多能性(Sato等人.,(2004)NatureMed.,10:55-63；美国专利公开Nos.2006/0030042和2005/0233446)。还有人在含FGF2、激活蛋白A和胰岛素的化学成分确定培养基中显示出了多能性的长期保持，但其中细胞都是在人血清包被(在细胞平板接种前“洗掉”)的平板上生长(Vallier等人.,2005JCellSci.,118(Pt19):4495-509)。尽管FGF2是所有这些培养基的成分，但是还不清楚它是否绝对必要，特别是在某些必须高浓度使用的制剂中(高至100ng/ml,Xu等人.,2005NatureMethods,2:185-189)。并且，所有的这些小组不是在他们的培养基中加入了μg/ml水平的胰岛素，就是因使用KSR而引入了胰岛素。胰岛素通常被认为在葡萄糖代谢和“细胞存活”信号传导中通过与胰岛素受体结合发挥作用。然而，当浓度高于生理浓度时，胰岛素也能与IGF1受体低效结合，并通过PI-3激酶/AKT途径提供经典的生长因子活性。在KSR或其他这样的培养基条件中存在/需要如此高的胰岛素水平(μg/ml水平)提示主要活性是通过与hESC表达的IGF1受体结合而引起的(Sperger等人.,2003PNAS,100(23):13350-13355)。其他人已经注意到IGF1R的完全互补物以及胞内信号途径成员在hESC中的表达，这可能预示着此途径的功能活性(Miura等人,2004AgingCell,3:333-343)。胰岛素或IGF1可以发出hESC自我更新所需的主要信号，正如以下事实所提示的，迄今为止开发的所有用于培养hESC的条件都或者含有胰岛素，或者含有KSR提供的胰岛素，或者含有血清提供的IGF1。支持这一观点的证据显示，若PI-3激酶在hESC培养物中被抑制，则细胞分化(D'Amour等人.,2005Nat.Biotechnol.,23(12):1534-41；McLean等人.,2007StemCells25:29-38)。最近发表的一篇文章描述了一种人源化的、成分确定的hESC培养基(Ludwig等人.,NatureBiotechnology,2006年1月1日在线发表,doi:10.1038/nbtl177)。然而这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含基础盐养分溶液和ErbB3配体的组合物，所述组合物基本不含血清。

【技术特征摘要】
2006.02.23 US 60/776,1131.一种包含基础盐养分溶液和ErbB3配体的组合物，所述组合
物基本不含血清。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物不含外源胰岛素和胰
岛素替代物。
3.权利要求2的组合物，其进一步包含胰岛素样生长因子或其
功能片段。
4.权利要求2的组合物，其中所述ErbB3配体选自神经调节蛋
白-1、调蛋白-β(HRG-β)、调蛋白-α(HRG-α)、Neu分化因子(NDF)、
乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)、胶质生长因子2(GGF2)、运动神经元
衍生因子(SMDF)、神经调节蛋白-2、神经调节蛋白-2β(NRG2-β)、表
皮调节素、Biregulin及其功能片段。
5.权利要求4的组合物，其中所述ErbB3配体是HRG-β或其功
能片段。
6.权利要求5的组合物，其进一步包含转化生长因子β
(TGF-β)、TGF-β家族成员或其功能片段。
7.权利要求6的组合物，其中所述TGF-β家族成员选自Nodal、
激活蛋白A、激活蛋白B、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、骨形态发生蛋
白-4(BMP4)及其功能片段。
8.权利要求7的组合物，其包含激活蛋白A。
9.权利要求8的组合物，其进一步包含胰岛素样生长因子或其
功能片段。
10.权利要求9的组合物，其中所述组合物不含外源成纤维细胞
生长因子。
11.权利要求9的组合物，其进一步包含至少一种选自FGF-2、
FGF-7、FGF-10、FGF-22及其功能片段的成纤维细胞生长因子(FGF)。
12.权利要求11的组合物，其中所述至少一种FGF为FGF-7、
FGF-10和FGF-22。
13.权利要求12的组合物，其进一步包含血清白蛋白(SA)。
14.权利要求13的组合物，其中所述SA为牛SA(BSA)或人SA
(HSA)。
15.权利要求14的组合物，其中所述SA的浓度大于大约0.2％体
积比(v/v)。
16.权利要求14的组合物，其中所述SA的浓度小于大约5％v/v。
17.权利要求16的组合物，其进一步包含至少一种不溶性基质。
18.权利要求17的组合物，其中所述至少一种不溶性基质选自胶
原、纤连蛋白及其片段。
19.一种组合物，其包含基础盐养分溶液和刺激可分化细胞中的
ErbB2-引导的酪氨酸激酶活性的成分。
20.权利要求19的组合物，其中所述刺激ErbB2-引导的酪氨酸激
酶活性的成分包括至少一种特异性结合所述可分化细胞中的ErbB3的
配体。
21.权利要求20的组合物，其中所述可分化细胞是灵长类动物胚
胎干细胞。
22.一种培养可分化细胞的方法，所述方法包括
a)将可分化细胞平板接种到细胞培养表面上；
b)给所述可分化细胞提供基础盐养分溶液；和
c)提供特异性结合ErbB3的配体。
23.权利要求22的方法，其中所述可分化细胞是灵长类动物胚胎
干细胞。
24.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·罗宾斯，T·舒尔茨，
申请(专利权)人：维亚赛特公司，
类型：发明
国别省市：美国;US