本发明专利技术属于一种牛源VCAM‑1多克隆抗体的制备方法及应用。该方法包括下列步骤：(1)、RNA提取；(2)、反转录PCR；(3)、引物；(4)、基因片段的扩增；(5)、基因的克隆；(6)、原核表达载体的构建；(7)、重组质粒在大肠杆菌中的表达及鉴定；(8)、重组蛋白质的纯化；(9)、蛋白印迹；(10)、重组蛋白的透析及浓度的测定；(11)、免疫抗原的制备；(12)、免疫及采血；(13)、血清的分离。本发明专利技术该多克隆抗体可用于识别牛重组VCAM‑1蛋白和天然牛源VCAM‑1蛋白,所述VCAM‑1多克隆抗体效价高，特异性强。特别是针对牛源天然VCAM‑1蛋白。
Preparation method and application of bovine origin VCAM-1 polyclonal antibody
The method and application of the invention belongs to a preparation of bovine VCAM 1 polyclonal antibody. The method comprises the following steps: (1), RNA (2), extraction; reverse transcription PCR; (3), (4), primers; the amplified gene fragment; (5), gene cloning; (6) and construction of prokaryotic expression vector; (7), expression and identification of recombinant plasmid in Escherichia coli; (8) and the purified recombinant protein; (9), Western blot; (10), and the recombinant protein concentration determination of dialysis; (11), immune antigen preparation; (12), immunity and blood; (13) isolation, serum. The polyclonal antibody of the invention can be used for the identification of Bovine Recombinant VCAM 1 protein and natural bovine VCAM 1 protein, the VCAM 1 polyclonal antibody with high titer and specificity. Especially for bovine natural VCAM 1 protein.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种牛源VCAM-1多克隆抗体的制备方法及应用。
技术介绍
VCAM-l于1989年首次由Osbom等人直接用真核基因表达方法克隆发现，VCAM-1主要表达在内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞表面,参与免疫细胞粘附和迁移。为了开展VCAM-1在奶牛乳腺炎中的免疫机制及功能的研究,一个高质量的纯化蛋白和高效且特异的VCAM-1抗体是必不可少的,然而牛源和鼠源VCAM-1之间的同源性极低，由于缺乏牛源VCAM-1商业抗体，关于牛源VCAM-1的生物功能的研究受到限制。
技术实现思路
本专利技术提供一种牛源VCAM-1多克隆抗体的制备方法及应用，本专利技术该多克隆抗体可用于识别牛重组VCAM-1蛋白和天然牛源VCAM-1蛋白,所述VCAM-1多克隆抗体效价高，特异性强。特别是针对牛源天然VCAM-1蛋白。本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：本专利技术牛源VCAM-1多克隆抗体的制备方法，包括下列步骤：(1)、RNA提取：按分子克隆实验法从健康奶牛中提取；(2)、反转录PCR；(3)、引物：通过比对该基因序列的酶切位点以及表达载体pET-28a和pGEX-4T-1的酶切位点，确定酶切位点,上游引物的酶切位点为EcoRI，下游引物酶切位点为XhoI，引物的具体信息如下：上游引物V15′-gaattctcccaaatcgacatattccc-3′；下游引物V25′-ctcgagTTAtttctcttgaacagttaatt-3′，斜体部分为酶切位点序列，下划线部分为终止密码子，扩增的目的片段长度为879bp；(4)、基因片段的扩增：以提取的RNA经反转录得到的cDNA为模板，以V1和V2为引物进行PCR扩增，反应体系为25μL，目的片段扩增的参数为：94℃3min；94℃1min，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；(5)、基因的克隆：A、PCR产物回收：按DNA凝胶回收试剂盒回收产物PCR；B、目的基因与pMD18-T克隆载体的连接：将回收的PCR产物与pMD18-T载体进行连接，混匀离心后置16℃连接10h；C、转化；D、质粒的小量制备；E、重组质粒的鉴定：提取质粒后，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，阳性克隆命名为DH5α-pMD18-VCAM-1；(6)、原核表达载体的构建：A、重组克隆质粒和表达载体的酶切及目的片段的回收：将测序正确的DH5α-pMD18-VCAM-1提取质粒，并应用EcoRⅠ和XhoⅠ对DH5α-pMD18-VCAM-1，原核表达载体pET28a和pGEX-4T-1进双酶切，然后用DNA回收纯化试剂盒回收目的DNA片段；B、重组表达载体的构建：将从重组克隆载体粒DH5α-pMD18-VCAM-1酶切下的目的片段分别与表达载体pET28a，pGEX-4T-1的DNA线性片段连接，混匀并离心后，置16℃水浴16h；取连接反应液转化BL21感受态细胞，转化；C、重组表达质粒的鉴定：用EcoRⅠ和XhoI双酶切鉴定、测序；阳性克隆命名为DH5α-pMD18-VCAM-1；(7)、重组质粒在大肠杆菌中的表达及鉴定：A、重组蛋白的诱导表达：0.1mM/LIPTG进行诱导，37℃振荡培养至OD600＝0.6，2～3h；B、表达产物的鉴定SDS-PAGE：分别取诱导和未诱导的菌液12000rpm离心1min，弃上清，菌体沉淀做SDS-PAGE分析；(8)、重组蛋白质的纯化：A、利用HisGraviTrap亲和纯化His标签融合蛋白；B、利用Gluthathione-Sepharose4B亲和纯化GST标签融合蛋白；(9)、蛋白印迹：一抗为TBST6000倍稀释鼠源抗His标签单抗，二抗为用TBST20000倍稀释羊抗鼠IgG抗体，碱性磷酸酶标记，BCIP/NBT显色液显色；(10)、重组蛋白的透析及浓度的测定：应用BCA蛋白浓度测定试剂盒；(11)、免疫抗原的制备：将已知浓度的重组蛋白His-VCAM-1进行稀释与弗氏佐剂按体积比1：1混合，乳化器中充分乳化，以乳化液滴入水中不散开为好；(12)、免疫及采血：A、免疫及采血，0周免疫前采血，0周免疫，2周采血，3周免疫，5周采血，6周免疫，8周采血，10周采血；B、免疫方法：3只大鼠,苦味酸标记，3次后腿肌肉注射免疫，各组大鼠免疫剂量50μg蛋白/500μL/只，并设一只阴性对照大鼠，间隔3周，第一次免疫前、每次免疫后2周尾静脉采血100μL并在第四次采血后2周后进行第五次采血；(13)、血清的分离：所采集Wistar大鼠血在37℃下静置2h后置于4℃冰箱过夜，待血清析出后，1500g离心10min，小心吸出血清分装放于-80℃保存。牛源VCAM-1多克隆抗体用于识别牛重组VCAM-1蛋白和天然牛源VCAM-1蛋白。本专利技术的有益效果为：本专利技术在大肠埃希氏菌克隆和表达了牛源VCAM-1基因，纯化了重组蛋白，制备了大鼠抗牛VCAM-1多克隆抗体。制备的抗体对研究VCAM-1在牛体内各种组织中的表达和分布以及阐述淋巴细胞在牛体内迁移机制、抗感染免疫机理提供了实验基础。本申请选择了两种标签进行亲和层析纯化蛋白，对基因工程菌pET-28a-VCAM-1和pGEX-4T-1-VCAM-1分别进行诱导表达，分别表达含有His标签和GST标签的重组蛋白VCAM-1，利用HisGraviTrapGluthathione-Sepharose4B纯化得到相应可溶蛋白，经鉴定正确。根据His标签无免疫原性特点，在后续实验里用VCAM-1-His作免疫抗原而VCAM-1-GST被用作检测抗原，由于His标签的低免疫原性，在免疫大鼠体内减少了产生抗重组蛋白标签抗体的可能性，而且通过不同标签的重组蛋白分别进行免疫和检测，避免了抗重组蛋白标签抗体的假阳性。VCAM-1-His和VCAM-1-GST重组蛋白的纯化是通过亲和层析进行的，因此保证了免疫抗原和检测抗原的纯度和质量。附图说明图1是VCAM-1基因的PCR扩增图；图2重组质粒pMD18-T-VCAM-1的酶切鉴定图；图3重组质粒pGEX-4T-1-VCAM-1的酶切鉴定图；图4重组质粒pET-28a-VCAM-1的酶切鉴定图；图5重组pGEX-4T-1-VCAM-1蛋白质在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析图；图6重组pET-28a-VCAM-1蛋白质在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析图；图7重组VCAM-1-GST蛋白的纯化图；图8重组VCAM-1-His蛋白的纯化图；图9重组蛋白VCAM-1-GS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛源VCAM‑1多克隆抗体的制备方法，包括下列步骤：(1)、RNA提取：按分子克隆实验法从健康奶牛中提取；(2)、反转录PCR；(3)、引物：通过比对该基因序列的酶切位点以及表达载体pET‑28a和pGEX‑4T‑1的酶切位点，确定酶切位点,上游引物的酶切位点为EcoRI，下游引物酶切位点为XhoI，引物的具体信息如下：上游引物V1 5′‑gaa ttc tcc caa atc gac ata ttc cc‑3′；下游引物V2 5′‑ctc gag TTA ttt ctc ttg aac agt taa tt‑3′，斜体部分为酶切位点序列，下划线部分为终止密码子，扩增的目的片段长度为879bp；(4)、基因片段的扩增：以提取的RNA经反转录得到的cDNA为模板，以V1和V2为引物进行PCR扩增，反应体系为25μL，目的片段扩增的参数为：94℃3min；94℃1min，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；(5)、基因的克隆：A、PCR产物回收：按DNA凝胶回收试剂盒回收产物PCR；B、目的基因与pMD18‑T克隆载体的连接：将回收的PCR产物与pMD18‑T载体进行连接，混匀离心后置16℃连接10h；C、转化；D、质粒的小量制备；E、重组质粒的鉴定：提取质粒后，用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，阳性克隆命名为DH5α‑pMD18‑VCAM‑1；(6)、原核表达载体的构建：A、重组克隆质粒和表达载体的酶切及目的片段的回收：将测序正确的DH5α‑pMD18‑VCAM‑1提取质粒，并应用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ对DH5α‑pMD18‑VCAM‑1，原核表达载体pET28a和pGEX‑4T‑1进双酶切，然后用DNA回收纯化试剂盒回收目的DNA片段；B、重组表达载体的构建：将从重组克隆载体粒DH5α‑pMD18‑VCAM‑1酶切下的目的片段分别与表达载体pET28a，pGEX‑4T‑1的DNA线性片段连接，混匀并离心后，置16℃水浴16h；取连接反应液转化BL21感受态细胞，转化；C、重组表达质粒的鉴定：用EcoR Ⅰ和Xho I双酶切鉴定、测序；阳性克隆命名为DH5α‑pMD18‑VCAM‑1；(7)、重组质粒在大肠杆菌中的表达及鉴定：A、重组蛋白的诱导表达：0.1mM/L IPTG进行诱导，37℃振荡培养至OD600＝0.6，2～3h；B、表达产物的鉴定SDS‑PAGE：分别取诱导和未诱导的菌液12000rpm离心1min，弃上清，菌体沉淀做SDS‑PAGE分析；(8)、重组蛋白质的纯化：A、利用His GraviTrap亲和纯化His标签融合蛋白；B、利用Gluthathione‑Sepharose 4B亲和纯化GST标签融合蛋白；(9)、蛋白印迹：一抗为TBST 6000倍稀释鼠源抗His标签单抗，二抗为用TBST 20000倍稀释羊抗鼠IgG抗体，碱性磷酸酶标记，BCIP/NBT显色液显色；(10)、重组蛋白的透析及浓度的测定：应用BCA蛋白浓度测定试剂盒；(11)、免疫抗原的制备：将已知浓度的重组蛋白His‑VCAM‑1进行稀释与弗氏佐剂按体积比1：1混合，乳化器中充分乳化，以乳化液滴入水中不散开为好；(12)、免疫及采血：A、免疫及采血，0周免疫前采血，0周免疫，2周采血，3周免疫，5周采血，6周免疫，8周采血，10周采血；B、免疫方法：3只大鼠,苦味酸标记，3次后腿肌肉注射免疫，各组大鼠免疫剂量50μg蛋白/500μL/只，并设一只阴性对照大鼠，间隔3周，第一次免疫前、每次免疫后2周尾静脉采血100μL并在第四次采血后2周后进行第五次采血；(13)、血清的分离：所采集Wistar大鼠血在37℃下静置2h后置于4℃冰箱过夜，待血清析出后，1500g离心10min，小心吸出血清分装放于‑80℃保存。...
【技术特征摘要】
1.一种牛源VCAM-1多克隆抗体的制备方法，包括下列步骤：
(1)、RNA提取：按分子克隆实验法从健康奶牛中提取；
(2)、反转录PCR；
(3)、引物：通过比对该基因序列的酶切位点以及表达载体pET-28a和pGEX-4T-1的酶切
位点，确定酶切位点,上游引物的酶切位点为EcoRI，下游引物酶切位点为XhoI，引物的具体
信息如下：上游引物V15′-gaattctcccaaatcgacatattccc-3′；下游引物V25′-
ctcgagTTAtttctcttgaacagttaatt-3′，斜体部分为酶切位点序列，下划线部分为
终止密码子，扩增的目的片段长度为879bp；
(4)、基因片段的扩增：以提取的RNA经反转录得到的cDNA为模板，以V1和V2为引物进行
PCR扩增，反应体系为25μL，目的片段扩增的参数为：94℃3min；94℃1min，54℃30s，72℃
1min，30个循环；72℃10min；
(5)、基因的克隆：A、PCR产物回收：按DNA凝胶回收试剂盒回收产物PCR；B、目的基因与
pMD18-T克隆载体的连接：将回收的PCR产物与pMD18-T载体进行连接，混匀离心后置16℃连
接10h；C、转化；D、质粒的小量制备；E、重组质粒的鉴定：提取质粒后，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶
切鉴定，阳性克隆命名为DH5α-pMD18-VCAM-1；
(6)、原核表达载体的构建：A、重组克隆质粒和表达载体的酶切及目的片段的回收：将
测序正确的DH5α-pMD18-VCAM-1提取质粒，并应用EcoRⅠ和XhoⅠ对DH5α-pMD18-VCAM-1，原
核表达载体pET28a和pGEX-4T-1进双酶切，然后用DNA回收纯化试剂盒回收目的DNA片段；B、
重组表达载体的构建：将从重组克隆载体粒DH5α-pMD18-VCAM-1酶切下的目的片段分别与
表达载体pET28a，pGEX-4T-1的DNA线性片段连接，混匀并离心后，置1...
【专利技术属性】
技术研发人员：常巧呈，陈媛媛，张乃生，杨正涛，罗英花，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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