聚乙二醇化的门冬酰胺酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种聚乙二醇化的门冬酰胺酶及其在药物制备中的应用和临床治疗中的应用。本发明专利技术PEG修饰的门冬酰胺酶中一分子门冬酰胺酶与13-45分子聚乙二醇偶联，所述聚乙二醇为平均分子量2-20KDa的直链聚乙二醇本发明专利技术制备的PEG修饰后的门冬酰胺酶。本发明专利技术提供的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，在具有降低免疫原性、半衰期明显延长等优点的基础上，聚乙二醇与门冬酰胺酶偶联得更加稳定，和市场上已销售的PEG化门冬酰胺酶的原研药和仿制药产品相比，本发明专利技术提供的聚乙二醇化的门冬酰胺酶结构更加稳定、PEG结合牢固、不易脱落，且均一性、活性都更高。

Pegylated L-asparaginase and its application

The present invention discloses one kind of poly (ethylene glycol) L-asparaginase and its application in medicine preparation and clinical application. A molecule of L-asparaginase, the invention of PEG modified L-asparaginase and 13-45 molecular polyethylene glycol conjugated asparaginase, straight chain polyethylene glycol polyethylene glycol as the average molecular weight of 2-20KDa modified PEG prepared by the invention after. Pegylated asparaginase provided by the invention, with reducing immunogenicity and prolong the half-life of the advantages of the coupling, and PEG asparaginase was more stable, and the market has been selling PEG asparaginase of the original drug and generic drug products than PEGylated L-asparaginase the present invention provides a structure of the enzyme is more stable, PEG combination is firm, not easy to fall off, and uniformity, higher activity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及聚乙二醇修饰的蛋白类药物，特别是聚乙二醇化的门冬酰胺酶及其在药物制备和临床治疗中的应用。
技术介绍
门冬酰胺酶(Asparaginase，ASP)又名L-门冬酰胺酶、L-天冬酰胺酶或L-天门冬酰胺酶，是一种催化天冬酰胺水解成天冬氨酸的酶。门冬酰胺酶可以有效的治疗儿童或成人中的急性淋巴细胞白血病(ALL)。最近几年，含有L-天冬酰胺酶的药物已经用于联合化疗方案来治疗NK/T细胞淋巴瘤，并取得了较好的治疗效果。NK/T细胞淋巴瘤是种特殊类型的非霍奇金淋巴瘤，多见于亚洲和拉丁美洲，我国发病率相对较高。根据肿瘤发生部位，NK/T细胞淋巴瘤可分为鼻型NK/T细胞淋巴瘤和非鼻型NK/T细胞淋巴瘤。另外L-天冬酰胺酶还被用于治疗何杰金氏病，急性骨髓白血病，急性骨髓单核细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，淋巴肉瘤，网状细胞肉瘤和黑素肉瘤(Kotziaandlabrou,J.Biotechnol.127(2007)657-669)。L-门冬酰胺酶的活性形式为4个亚基组成的同源四聚体结构，每一亚基由326个氨基酸组成。L-天冬酰胺酶最初从若干生物体中纯化，包括大肠杆菌(E.coli)和软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)。在哺乳动物中，仅在豚鼠(Cavioidea超科)和某些阔鼻猴(NewWorldmonkey)中发现略高于痕量的L-天门冬酰胺酶。但是，由于它来源于外源生物，对人而言是一种外源蛋白，有较强的免疫原性，临床上常见进行性免疫反应和全身性过敏反应，而限制了其临床应用。(张丽娜，宫道华.江苏医药.左旋门冬酰胺酶治疗小儿急性淋巴细胞性白血病的毒副反应.2005，31(5)：392；王宁玲，刘芝璋等.左旋门冬酰胺酶治疗儿童白血病的毒副作用及防治.中国小儿血液，2005，10(3)：133)。为此，如何获得低免疫性性的L-门冬酰胺酶，改善该蛋白酶的药代动力学以提高耐受性及给药便利程度，一直是研究的重点。解决上述问题的方法之一就是对L-门冬酰胺酶进行适当的化学修饰。聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG修饰技术在生物医学和生物
得到了广泛的应用，PEG已经被广泛地应用于蛋白质，多肽类药物的修饰研究。目前蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性，以及改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一，且已通过FDA认证可用于药物、食品和化妆品。聚乙二醇修饰技术经历了几十年的发展，目前虽然已经比较成熟。但并不能找出一种通用的聚乙二醇修饰剂以及修饰方法来对所有的蛋白药物进行修饰。蛋白的结构以及所用PEG的分子量、形状以及修饰的位点等对聚乙二醇化的蛋白质的生物活性以及药效有很大的影响。对于特定药物的修饰，聚乙二醇修饰剂是影响修饰产物理化性质、体内外生物活性、药代动力学、药效学以及修饰产物临床表现最重要的因素。因此，修饰剂的选择(修饰剂种类、分子量大小)以及修饰反应的控制在聚乙二醇修饰技术中占有重要地位。蛋白质结构的解析并不能准确预测天然蛋白质的药代动力学行为，而在蛋白偶联上PEG以后由于引入了许多新的变量如分子量、修饰剂种类等，对于PEG偶联物的药代动力学行为预测变得更加不可能。为此，针对不同的蛋白质药物，需要通过选择不同种类以及不同分子量的修饰剂，并通过理化性质检测、动物实验评价等确定最佳方案。例如，在大多数情况下，与未修饰的原蛋白相比，聚乙二醇化的蛋白药物的活性会降低，一般修饰后的蛋白活性仅有原蛋白的30％-40％,甚至更低。例如Schering-Plough公司的PEG-Intron,是用分子量为5000的PEG修饰干扰素，修饰后其活性只有原蛋白的8％。又如Yoshihiro等分别用分子质量为750，1900，5000U的分支状活化PEG(2-0一methoxypolyethyleneglycol-4，6-dichloro-s-triazine)对大肠杆菌门冬酰胺酶进行修饰。其中5000u一PEG修饰了门冬酰胺酶所有92个游离氨基(88个δ-氨基与4个α-氨基)中的73个，保留原酶活性的7％，修饰后产物完全失去与门冬酰胺酶抗性血清结合能力。此外，一般随着PEG分子量的增大，修饰后的蛋白质活性降低更明显。例如用分子量为20KDa、30KDa、40KDa的PEG修饰促红细胞生成素(EPO)后，活性随着PEG分子量的增大而显著减小(Yin-jueWang,journalofcontrolledrelease,2010(145):306-313)。Bailon等采用分支型40kDaPEG修饰Interferon-α-2a，所得单修饰物获得较长的循环半衰期，但是仅仅保留了7％的体外活性(BailonP,BioconjugateChem.,2001,12:195-202.)。目前针对L-门冬酰胺酶的聚乙二醇修饰研究已有很多。国外利用聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的产品Oncaspar(Enzoninc)早在1994年就已上市，并在2006年起被批准作为儿童和成人的ALL的一线疗法。但是Oncaspar的体外和体内的稳定性差、容易脱落，并且副作用也较大。而国内目前上市的PEG修饰的L-门冬酰胺酶只有恒瑞公司的“培门冬酶”，它是Oncaspar的仿制药，也存在着PEG容易降解脱落、均一性差、活性降低严重等的问题。同时，目前也有一部分PEG定点修饰L-门冬酰胺酶有关论文或专利，但是这些修饰剂价格更为昂贵，且修饰工艺更为复杂，收率较低，整个制造成本较高，并不适宜产业化运用。因此，本领域迫切需要提供一种生产成本低廉、更加稳定、PEG不易脱落的聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术旨在提供一种在具有长半衰期、低免疫原性、低成本等优点的基础上，PEG不易脱落、高收率、高均一性的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，及其制备治疗儿童或成人急性淋巴细胞白血病等疾病的药物中的应用。技术方案：本专利技术的第一目的是提供一种聚乙二醇化的门冬酰胺酶，其中一分子门冬酰胺酶与13-45分子聚乙二醇偶联，所述聚乙二醇为平均分子量2-20KDa的直链聚乙二醇。作为优选，PEG通过与门冬酰胺酶的游离氨基形成酰胺键或本文档来自技高网...

【技术保护点】
聚乙二醇化的门冬酰胺酶，其特征在于，一分子门冬酰胺酶与13‑45分子聚乙二醇偶联，所述聚乙二醇为平均分子量2‑20KDa的直链聚乙二醇，所述聚乙二醇通过与门冬酰胺酶游离的氨基形成酰胺键或脲烷键来与门冬酰胺酶偶联。

【技术特征摘要】
1.聚乙二醇化的门冬酰胺酶，其特征在于，一分子门冬酰胺酶与13-45分子聚乙二醇偶联，
所述聚乙二醇为平均分子量2-20KDa的直链聚乙二醇，所述聚乙二醇通过与门冬酰胺酶游
离的氨基形成酰胺键或脲烷键来与门冬酰胺酶偶联。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，所述游离氨基包括赖氨酸残基和/或N-
末端氨基。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，其结构通式如下所示：
其中
n是0到3的整数；m为13-45的整数；ASP是L-门冬酰胺酶。
4.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，其由以下方法制备得到：
第一步：缓冲液置换
把门冬酰胺酶原料药溶液吸入离子交换层析柱，用平衡缓冲液平衡、用洗脱缓冲液洗脱，
收集洗脱蛋白，所述洗脱缓冲液同时为下一步修饰反应中的修饰缓冲液；
第二步：修饰反应及修饰产物纯化
将第一步中收集的门冬酰胺酶溶液按门冬酰胺酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，王俊，吴鼎龙，闻兴元，王和，徐春林，陈一飞，王耀方，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32