一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法技术

本发明专利技术提供了一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，属于煤层水样微生物分析。本发明专利技术要解决的技术问题是从成分复杂的煤层水样中提取微生物总DNA的方法。本发明专利技术方法包括以下步骤：煤层水样的预处理，通过离心去除大颗粒杂质，采用膜过滤的方式收集水样中的微生物；微生物细胞破碎，将收集好微生物的滤膜剪碎后重悬在缓冲液中，用珠磨器法破碎细胞，再用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠溶液在55℃孵育2h‑4h，至溶液澄清；微生物总DNA的纯化和沉淀，用酚‑氯仿法去除杂蛋白，加入异丙醇沉淀收集总DNA。本发明专利技术的总DNA提取方法适合于成分复杂的煤层水样及相关样品，细胞破碎效果好，提取的基因组纯度高、完整性好，可直接用于后续的宏基因组学分析、DGGE分析等。

【技术实现步骤摘要】
一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法
：本专利技术属于分子生物学
，具体涉及从煤层水样中提取微生物总DNA的方法。
技术介绍
：煤层气是成煤过程中生成的非常规天然气，是一种洁净的化石能源。据国际能源机构(IEA)估计，全世界煤层气资源量达263.8×1012m3，其中我国煤层气资源量约30×1012-36.81×1012m3，开发潜力巨大。煤层气的开发不仅可以改善我国能源以煤炭为主，石油供给不足的格局，而且有助于煤矿的安全开采，减少温室气体排放，改善大气环境。煤层气按其成因可分为生物成因气、热成因气或混合成因气。其中，生物成因气是以微生物为产气主体。近年来，美国、加拿大等国家在生物成气方面开展的大量研究，其中，解析产气微生物群落的结构有助于掌握功能微生物的类型，为实现调控微生物成气奠定理论基础。我国目前也在煤层气生物成气方面开展了一些工作，鉴于煤层微生物中存在大量极端且不可培养的微生物，常规分离培养等分析方法无法确定微生物的种类与丰度。宏基因组学、分子指纹图谱技术等免培养技术的发展，为揭开不可培养微生物的神秘面纱提供了技术支撑。因此，高质量的微生物基因组提取方法成为决定数据准确全面的关键。由于煤层水样组成复杂，水样中除了含有煤颗粒外，还存在大量理化性质复杂的物质，目前还没有一种适合煤层水样中微生物基因组高效提取的方法。当前煤层水样品中微生物总DNA的提取多数采用试剂盒法，但是并没有针对煤层水样品的专用试剂盒，由于样品中腐殖酸、吸附性颗粒等杂质的影响，采用高温及化学法来破壁的试剂盒的缺陷在于菌体细胞破碎并不彻底。已经公布的类似的基因组提取专利，如中国专利《一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法》(申请号：201410186729.2)，中国专利《一种煤层气田地下水微生物检测方法》(申请号：201110005095.2)，其中涉及DNA提取的方法采用的是试剂盒法，而中国专利《煤矿酸性矿井水底泥DNA提取方法》(申请号：200810231369.8)，中国专利《一种矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法》(专利号：CN103642798A)，由于样品性质和组成与煤层水样有较大差异，上述方法并不适用于煤层水样中的微生物基因组的提取。因此，开发适合于煤层水样中微生物总DNA的提取方法对于研究煤层气田微生物群落结构与丰度具有重要意义。
技术实现思路
：本专利技术的目的是针对上述现有技术的不足，建立一种适合从成分复杂的煤层水样中高效提取微生物的总DNA的方法，解决基因组提取过程中细胞破碎的关键步骤，采用珠磨器机械破碎、化学破碎与酶消化相结合的方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，包括如下步骤：1)煤层水样的预处理：取煤层水样10-20mL通过低速离心去除大颗粒杂质，收集上清液，采用抽滤的方式将水样中的微生物收集到滤膜上，将滤膜剪碎后置于STE缓冲液中，待用；所述STE缓冲液组成包括：NaCl0.1-0.2g/L，Tris-HCl20-40mmol/L，EDTA0.3-0.6mol/L，溶剂为ddH2O；2)微生物细胞的破碎：将含有滤膜的缓冲液移入含有玻璃珠的预冷螺旋帽管中，用珠磨器对细胞进行破碎，重复2-3次，重复过程中将上清液移至离心管后，再向螺旋帽管加满STE缓冲液，将所有上清液合并，加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液，充分混匀后置于55℃水浴锅内孵育2-4h；3)微生物DNA的抽提、纯化及沉淀：向孵育后的液体中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，11000-13000×g离心10-30min，取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液抽提，除去酚类物质和脂类物质，11000-13000×g离心10-30min，收集上清液，加入1-2倍体积的异丙醇，于-20℃低温沉淀1-2h，用预冷的75％乙醇洗涤沉淀，11000-13000×g离心10-30min，弃上清，室温放置至乙醇挥发完全后，加入50-150μL的TE缓冲液溶解沉淀，溶解后加入RNaseA去除RNA，得到微生物基因组总DNA。其中，步骤1)所述去通过低速离心去除大颗粒杂质，离心转速为1000-2500×g，离心时间为5-10min。其中，步骤1)所述滤膜置于的STE缓冲液的体积为5-10mL。其中，步骤1)所述采用抽滤方式将水样中的微生物收集到滤膜上，滤膜孔径为0.22μm。其中，步骤2)玻璃珠的添加量为0.6-0.8g，玻璃珠直径为0.3mm。其中，步骤2)所述珠磨器转速为1500-3500rpm，破碎时间15-45s。其中，步骤2)所述蛋白酶K的终浓度为20-50mg/mL，SDS的质量体积比为5％-10％。其中，步骤1)所述的煤层水样可以用煤炭厌氧发酵液替代。本专利技术所述方法从煤层水样和煤炭厌氧发酵液中提取得到的微生物总DNA，浓度和纯度较高，经检测微生物总DNA的完整性较好，可直接用于宏基因组高通量测序和DGGE分析。与现有技术相比本专利技术的有益效果：1.本专利技术的微生物总DNA提取方法适用于煤层水样、煤炭厌氧发酵液等。2.本专利技术的方法采用低速离心去除煤层水样中的大颗粒杂质，根据样品特点，使用珠磨器机械振荡破碎、化学法和酶消化的方法高效地实现了微生物总DNA的提取，得到的基因组的完整性较好，纯度和浓度较高，所需试剂均可从公司直接购买。3.本专利技术所述的DNA提取方法适合于从煤层水样中提取出古菌和细菌的总基因组，通过珠磨器法可以快速高效地完成微生物细胞的破壁，化学法和酶消化法有助于去除杂蛋白、腐殖酸等杂质。本方法提取得到的总DNA片段完整性较好、纯度高，可直接用于后续的宏基因组学分析、DGGE(变性梯度凝胶电泳)分析和PCR(聚合酶链式反应)扩增。附图说明：图1为本专利技术方法提取的煤层水样微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道M为DNAmarkerλDNA-HindⅢ，泳道1为煤层水样微生物总DNA。图2为某公司试剂盒提取煤层水样总DNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道M为DNAmarkerλDNA-HindⅢ，泳道1-3分别为三个不同煤层水样中总DNA的提取结果。图3为本专利技术方法提取的煤层水样和煤炭厌氧发酵后的水样微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中M为DNAmarkerλDNA-HindⅢ，泳道1和2为煤层水样微生物总DNA，泳道3和4为煤炭厌氧发酵后的水样微生物总DNA。图4为煤层水样提取DNA扩增细菌16SrDNA片段琼脂糖电泳图；其中泳道1和2为本专利技术方法提取的微生物总DNA扩增得到的细菌16SrDNA片段，泳道3和4为公司试剂盒提取的微生物总DNA扩增得到的细菌16SrDNA片段。图5为不同方法提取煤层水样中微生物总DNA扩增古菌16SrDNA片段的琼脂糖电泳图；其中泳道1-3为公司试剂盒提取的微生物总DNA扩增得到的古菌16SrDNA片段，泳道4-7为本专利技术方法提取的微生物总DNA扩增得到的古本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)煤层水样的预处理：取煤层水样10‑20mL通过低速离心去除大颗粒杂质，收集上清液，采用抽滤的方式将水样中的微生物收集到滤膜上，将滤膜剪碎后置于STE缓冲液中，待用；所述STE缓冲液组成包括：NaCl 0.1‑0.2g/L，Tris‑HCl 20‑40mmol/L，EDTA 0.3‑0.6mol/L，溶剂为ddH2O；2)微生物细胞的破碎：将含有滤膜的缓冲液移入含有玻璃珠的预冷螺旋帽管中，用珠磨器对细胞进行破碎，重复2‑3次，重复过程中将上清液移至离心管后，再向螺旋帽管加满STE缓冲液，将所有上清液合并，加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠水溶液，充分混匀后置于55℃水浴锅内孵育2‑4h；3)微生物DNA的抽提、纯化及沉淀：向孵育后的液体中加入等体积的酚‑氯仿‑异戊醇混合液，11000‑13000×g离心10‑30min，取上清液，加入等体积的氯仿‑异戊醇混合液抽提，除去酚类物质和脂类物质，11000‑13000×g离心10‑30min，收集上清液，加入1‑2倍体积的异丙醇，于‑20℃低温沉淀1‑2h，用预冷的75％乙醇洗涤沉淀，11000‑13000×g离心10‑30min，弃上清，室温放置至乙醇挥发完全后，加入50‑150μL的TE缓冲液溶解沉淀，溶解后加入RNaseA去除RNA，得到微生物基因组总DNA。...

【技术特征摘要】
1.一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)煤层水样的预处理：取煤层水样10-20mL通过低速离心去除大颗粒杂质，低速离心转速为1000-2500×g，离心时间为5-10min，收集上清液，采用抽滤的方式将水样中的微生物收集到孔径为0.22μm的滤膜上，将滤膜剪碎后置于5-10mLSTE缓冲液中，待用；所述STE缓冲液组成包括：NaCl0.1-0.2g/L，Tris-HCl20-40mmol/L，EDTA0.3-0.6mol/L，溶剂为ddH2O；
2)微生物细胞的破碎：将含有滤膜的缓冲液移入预冷的螺旋帽管中，向螺旋帽管中添加质量为0.6-0.8g、直径为0.3mm的玻璃珠，采用珠磨器对细胞进行破碎，珠磨器的转速为1500-3500rpm，破碎时间15-45s，重复2-3次，重复过程中将上清液移至离心管后，再向螺旋帽管加满STE缓冲液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀清，吴瑞薇，聂志强，王保玉，韩作颖，
申请(专利权)人：山西大学，易安蓝焰煤与煤层气共采技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：山西;14