一种大熊猫精子的冷冻保存方法技术

本发明专利技术提供了一种大熊猫精子的冷冻保存方法，包括以下步骤：收集大熊猫精液；将所述精液放入冻精管中，并将所述冻精管放入程控冷冻仪的腔体，所述腔体的腔体内温度为15℃‑24℃；对放置有所述冻精管的所述腔体的所述腔体内温度进行梯度降温，所述梯度降温包括第一降温阶段和第二降温阶段；以及将经过所述梯度降温的所述冻精管放入液氮进行保存。这种方法采用程序梯度降温，操作简单，同时，能够提高大熊猫精液的精子活力和冷冻恢复率，提高冻存精子的质量。

【技术实现步骤摘要】
一种大熊猫精子的冷冻保存方法
本专利技术涉及动物精子保存
，具体而言，涉及一种大熊猫精子的冷冻保存方法。
技术介绍
大熊猫是我国特有的珍稀物种，繁殖能力低下，发情期短。在圈养大熊猫种群中，由于同时处于繁殖期的雌雄大熊猫数量较少，自然交配的成功率较低，所以有时候会采取人工受精的方法促使大熊猫怀孕。人工采集到的大熊猫精液，其中的活性精子在常温环境中会逐渐失去活性，影响人工受精的受胎率。现有的大熊猫精液冷冻技术为颗粒冻精技术，这种技术由于冷冻时仅仅是通过调整冷冻面与液氮面之间的距离来确定精液的初冻温度。由于手工操作的间歇性，致使在将精液滴到金属板上的过程中，同一批次中精子与金属板的接触时间有差异，使得同一批次精液冷冻效果不一致，影响冻存精子的质量。复苏后，由于同一批次精子的活性差异大，会极大的降低人工受精的成功率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种大熊猫精子的冷冻保存方法，这种方法能够提高冻存精子的质量，以进一步增大熊猫人工受精的成功率。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种大熊猫精子的冷冻保存方法，包括以下步骤：a.收集大熊猫精液；b.将所述a步骤中所得的所述精液放入冻精管中，将所述冻精管放入程控冷冻仪的腔体内，所述腔体的温度为15℃-24℃；c.对所述腔体进行梯度降温：第一降温阶段，以第一冷却速率将所述腔体的温度降低至第一冷冻温度，所述第一冷却速率为89℃/min-109℃/min，所述第一冷冻温度为-122℃至-102℃；第二降温阶段，以第二冷却速率将所述腔体的温度降低至第二冷冻温度，所述第二冷却速率为以65℃/min-85℃/min，所述第二冷冻温度为-175℃至-155℃；随后将所述冻精管放入液氮进行保存。现有技术中，大熊猫精液的冻存方法主要有三种：颗粒法、安瓿法和冻管法。其中，颗粒法设备简单，在操作过程中容易使冻存精液受到污染，同时由于在夹取过程中颗粒暴露在室温中的时间过长，使得冻存精子的复苏率低。安瓿法操作繁琐，封口和拆封均有一定难度，且在封口时可能由于冷热不均引起爆炸,对操作人员及精液造成损伤。冻管法的操作相对简单，但由于在手动冷冻的过程中，不同操作员的手法不一，会对大熊猫的精子活率产生不同程度的影响。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)将装有大熊猫精液的冻精管放置于程控冷冻仪的腔体，采用程序梯度降温法，以不同的冷却速率分两个阶段降低腔体内温度，操作简单，便于自动化控制，减少人为操作对熊猫冻存精液质量的影响。(2)通过控制程控冷冻仪腔体内温度的冷却速率，使腔体内温度以第一冷却速率89℃/min-109℃/min降低至第一冷冻温度(-122℃至-102℃)后，再以第二冷却速率65℃/min-85℃/min降低至第二冷冻温度(65℃/min-85℃/min)，这种梯度降温可使位于腔体内冻精管中的精子细胞快速跨越冰晶期，避免精子细胞中产生冰晶，减少冰晶对精子膜的损伤，提高大熊猫精液的精子活力和冷冻恢复率，提高冻存精子的质量。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本实施方式提供的一种大熊猫精子的冷冻保存方法，包括以下步骤。步骤a.收集大熊猫精液。在本专利技术较佳的实施例中，例如是采用电刺激法收集精液。具体的，用氯胺酮(7mg/kg)对大熊猫进行麻醉后，用电极棒刺激大熊猫。刺激电压从2V开始，根据大熊猫后肢收缩的程度，缓慢增加刺激电压。每次刺激时间约为2秒，刺激的间隔时间约为3秒。持续刺激直至采出精液。采集到的精液可用稀释液TEST(IrvineScientific的产品)进行稀释，并用甘油做保护剂。步骤b.将步骤a中所得的精液放入冻精管中，并将冻精管放入程控冷冻仪的腔体内，腔体的腔体内温度为15℃-24℃。在本专利技术较佳的实施例中，将所得的冻精管放入程控冷冻仪的腔体时，腔体的腔体内温度优选为17℃-22℃。当腔体的温度优选为17℃-22℃时，能够减少冻精管转移至程控冷冻仪时对大熊猫精子活力的影响，从而进一步的提高冻存精子的质量。进一步优选地，在将精液放入冻精管前，精液在2℃-8℃的冷藏设备中放置2-8小时。在将精液放入冻精管前，精液在低温中冷藏平衡一段时间，避免细胞在室温中活性下降，有助于保持精子细胞的活性。进一步优选地，冻精管装好精液后可使用密封机对冻精管进行密封处理。步骤c.对腔体进行梯度降温：第一降温阶段，以第一冷却速率将腔体的温度降低至第一冷冻温度，第一冷却速率为89℃/min-109℃/min，第一冷冻温度为-122℃至-102℃；第二降温阶段，以第二冷却速率将腔体的温度降低至第二冷冻温度，第二冷却速率为以65℃/min-85℃/min，第二冷冻温度为-175℃至-155℃；随后将冻精管放入液氮进行保存。在本专利技术较佳的实施例中，第一降温阶段中的第一冷却速率优选为94℃/min-104℃/min。当第一冷却速率为94℃/min-104℃/min时，冻精管内的精子细胞能够以较快的速度跨越冰晶期，从而保护精子细胞免受冰晶的破坏。进一步优选地，第一降温阶段中的第一冷却速率为92℃/min-98℃/min。当第一冷却速率为92℃/min-98℃/min时，冻精管内的精子细胞能够以较快的速度跨越冰晶期，减少细胞内形成冰晶的数量，从而最大限度的降低冰晶对精子细胞膜的损伤，有利于提高冻存精子的质量。在本专利技术较佳的实施例中，第一降温阶段中的第一冷冻温度优选为-117℃至-107℃。第一降温阶段结束后，程控冷冻仪中腔体的腔体内温度为-117℃至-107℃，有利于减少精子细胞的损伤，提高冻存精子解冻后的细胞活力。进一步的，在本专利技术较佳的实施例中，第二冷却阶段中的第二冷却速率为70℃/min-80℃/min。第二冷却速率较第一冷却速率小，腔体内温度在第二冷却阶段时降温相对比较平缓，当第二冷却速率为70℃/min-80℃/min时，精液所在环境中的温度变化对精子细胞的损伤相对较小。第二冷却速率进一步优选为73℃/min-78℃/min，此时腔体内的温度变化对精子细胞的损伤程度最小。在本专利技术较佳的实施例中，第二降温阶段中的第二冷冻温度优选为-170℃至-160℃。第二降温阶段结束后，程控冷冻仪中腔体的腔体内温度为-170℃至-160℃，有利于减少精子细胞的损伤，提高冻存精子解冻后的细胞活力，进一步提高冻存精子的质量。实施例1一种大熊猫精子的冷冻保存方法，包括以下步骤:1.大熊猫精液采集：用氯胺酮(7mg/kg)对大熊猫进行麻醉后，用电极棒刺激大熊猫。刺激电压从2V开始，根据大熊猫后肢收缩的程度，缓慢增加刺激电压。每次刺激时间2秒，刺激的间隔时间为3秒。持续刺激直至采出精液。2.将采集到的精液用稀释液TEST(IrvineScientific的产品)进行稀释。稀释前在稀释液TEST中加入冷冻保护剂甘油，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。稀释后的精液中精子的密度为5×108个/ml，即稀释后的每毫升精液中有5×108个精子细胞。。将上述精液放置于4℃冰箱中平本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大熊猫精子的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤:收集大熊猫精液；将所述精液放入冻精管中，并将所述冻精管放入程控冷冻仪的腔体，所述腔体的腔体内温度为15℃‑24℃；对放置有所述冻精管的所述腔体的所述腔体内温度进行梯度降温，所述梯度降温包括第一降温阶段和第二降温阶段，所述第一降温阶段是以第一冷却速率将所述腔体内温度降低至第一冷冻温度，所述第一冷却速率为89℃/min‑109℃/min，所述第一冷冻温度为‑122℃至‑102℃，所述第二降温阶段是以第二冷却速率将所述腔体内温度降低至第二冷冻温度，所述第二冷却速率为65℃/min‑85℃/min，所述第二冷冻温度为‑175℃至‑155℃；以及将经过所述梯度降温的所述冻精管放入液氮进行保存。

【技术特征摘要】
1.一种大熊猫精子的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤:收集大熊猫精液；将所述精液放入冻精管中，并将所述冻精管放入程控冷冻仪的腔体，所述腔体的腔体内温度为15℃-24℃；对放置有所述冻精管的所述腔体的所述腔体内温度进行梯度降温，所述梯度降温包括第一降温阶段和第二降温阶段，所述第一降温阶段是以第一冷却速率将所述腔体内温度降低至第一冷冻温度，所述第一冷却速率为89℃/min-109℃/min，所述第一冷冻温度为-122℃至-102℃，所述第二降温阶段是以第二冷却速率将所述腔体内温度降低至第二冷冻温度，所述第二冷却速率为65℃/min-85℃/min，所述第二冷冻温度为-175℃至-155℃；以及将经过所述梯度降温的所述冻精管放入液氮进行保存。2.根据权利要求1所述的大熊猫精子的冷冻保存方法，其特征在于，将装有所述精液的所述冻精管放入所述程控冷冻仪的所述腔体时，所述腔体内温度为17℃-22℃。3.根据权利要求1所述的大熊猫精子的冷冻...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄炎，周应敏，李德生，张和民，王鹏彦，张明春，
申请(专利权)人：四川卧龙国家级自然保护区管理局，
类型：发明
国别省市：四川;51