一种突变MspA蛋白单体及其表达基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种突变MspA蛋白单体及其表达基因和应用，所述蛋白单体是由野生型MspA蛋白突变所得，所述野生型MspA蛋白包含序列表SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列，所述突变发生在所述序列表SEQ ID NO:1中的88位到116位的区域内的一个或多个氨基酸；所述蛋白单体能够形成八聚体的纳米孔。相对于现有技术，本发明专利技术所提供的突变MspA蛋白单体，能够形成八聚体纳米通道，可明显地改善野生型MspA蛋白纳米孔在外加高偏置电压下产生的自发阻塞效应，且增大对分析物的捕获率，并且一定程度阻滞分析物通过其孔道，降低过孔速率，增加检测精度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种突变MspA蛋白单体及其表达基因和应用，属于纳米传感

技术介绍
传统的测序技术主要是依赖于扩增技术来产生大量的核酸，并且需要对标记的化学物质的荧光信号进行检测，因此不仅速度缓慢，而且价格昂贵。而纳米孔测序是通过将DNA分子电泳通过一个薄而小的纳米孔内，由于不同碱基理化性质的差异，其对孔的电流阻塞效应不同，通过对阻塞电流的分辨而得知DNA分子内碱基的序列信息。因此，基于纳米孔的测序方法具有相当大的优势，包括(1)非标记，(2)不需要扩增，(3)高通量，(4)成本低廉，(5)样本需求量小，(6)读长长。根据材料的性质，纳米孔分为生物纳米孔和固态纳米孔，两者各有优劣。固态纳米孔具有更易保存、化学稳定性好、尺寸大小可控等方面的优势。除此之外，在不同溶液的不同浓度下固态纳米孔可以使用更长的时间，而生物纳米孔能够提供原子精度的结构和遗传信息的潜力。常用做生物纳米孔的蛋白质除了金黄色葡萄球菌的α-溶血素之外，耻垢分支杆菌中的孔蛋白(MspA)显示出了更好的应用前景。MspA孔蛋白是由八个MspA单体互相紧密连接形成的旋转对称的酒杯状八聚体，每个单体由184个氨基酸组成，其中134个氨基酸残基球状结构域装配成杯身,而另外50个氨基酸残基环形成杯柄和底座[FallerM.,etal.Thestructureofamycobacterialouter-membranechannel.Science,2004,303(5661):1189-1192.]。MspA孔蛋白有一个大约宽1.2nm，长0.6nm的短窄的颈缩区，使得不同核苷酸通过该通道能产生更易分辨的特征阻塞电流[DerringtonI.M.,etal.NanoporeDNAsequencingwithMspA.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2010,107(37):16060-16065.]。在外加电场的驱动下DNA分子从纳米孔中易位，于是就形成了电流阻塞信号。由于野生型MspA的颈缩区富集了带负电荷的氨基酸，通常情况下带负电的DNA分子难以通过，且会在高外加电压下出现自发阻塞堵孔效应。2008年Butler等[Butler,T.Z.,etal.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2008,105(52):20647-20652.]通过将处于MspA纳米孔通道收缩区的90、91、93号带负电荷氨基酸突变为中性氨基酸，得到了MspA突变体M1MspA(D90N/D91N/D93N/)。其表达水平及通道形成活性与野生型MspA蛋白没有差异，且消除了收缩区的负电荷，很好地改善了野生型MspA在高于180mV偏置电压下会产生自发阻塞效应的现象，从而使得带负电的ssDNA可在外加偏置电压驱动下通过该通道实现单分子检测。另外，他们将处于通道前庭区的118、134、139号带负电荷的氨基酸突变为带正电荷的氨基酸，得到MspA的突变体M2MspA(D90N/D91N/D93N/D118R/E139K/D134R)，由于减小了前庭区对ssDNA的静电斥力，并有效地阻止了ssDNA从前庭区逸出，其对ssDNA的捕获率提高了近20倍，ssDNA易位产生的电流阻塞事件的持续时间比在M1MspA中增长了近百倍，且驱动ssDNA分子过孔所需施加的偏置电压只为之前的一半。2012年Bhattacharya等[BhattacharyaS.,etal.MolecularDynamicsStudyofMspAArginine-MutantsPredictsSlowDNATranslocationsandIonCurrentBlockadesIndicativeofDNASequence.ACSnano,2012,6(8):6960-6968.]则通过全原子分子动力学(MD)模拟了在M1MspA蛋白基础上进一步在通道颈缩区进行精氨酸突变的三种MspA突变体：L88R-NNN、L88R/T83R/S116R-NNN和L88R/A96R/S116R-NNN。由于突变后替换的精氨酸上的胺基可以和DNA骨架上的磷酸基形成盐桥，且精氨酸的侧链会和胞嘧啶碱基叠加到一起，从而短暂地阻滞了DNA通过通道，增大了DNA的捕获率，并大大降低了DNA的过孔速度。然而这项研究仅仅停留在模拟阶段，未通过真正的蛋白质工程实验进行验证。综上所述，野生型MspA不适宜直接用于分析物检测，需要预先对其颈缩区及附加的氨基酸进行相应结构和功能性突变才可真正应用表征。而现有MspA蛋白突变技术中，只是分别对前庭区和颈缩区的特定氨基酸进行相应替换，虽然一定程度上增加了对分析物的捕获率，但是，实际表征过程中对分析物过孔速度控制，主要还是通过使用phi29DNA聚合酶等马达分子来实现[Derrington,I.M.,etal.,Subangstromsingle-moleculemeasurementsofmotorproteinsusingananopore.Naturebiotechnology,2015.33(10):p.1073-1076.]，不仅步骤繁琐，而且成本较高。
技术实现思路
专利技术目的：为了解决上述技术问题，本专利技术通过设计和构建所述的突变MspA蛋白单体来改变其聚合体的空间结构、净电荷、与分析物成键或基团反应能力，从而改善野生型MspA蛋白纳米孔在外加高偏置电压下产生的自发阻塞效应，且增大对分析物的捕获率，并且一定程度阻滞分析物通过其孔道，降低过孔速率，增加检测精度。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种突变MspA蛋白单体，所述蛋白单体是由野生型MspA蛋白突变所得，所述野生型MspA蛋白包含序列表SEQIDNO:1中所示氨基酸序列，所述突变发生在所述序列表SEQIDNO:1中的88位到116位的区域内的一个或多个氨基酸；所述蛋白单体能够形成八聚体的纳米孔。所述一个或多个氨基酸突变改变蛋白单体的(1)空间结构；(2)净电荷；(3)与分析物成键或基团反应能力。所述蛋白单体在两亲性分子形成的双层结构上可自组装形成八聚体纳米孔通道；所述的两亲性分子，可以是磷脂或其他聚合物。作为优选，所述蛋白单体包含序列表SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5中所示氨基酸序列。作为另一种优选，所述突变为：所述一个或多个氨基酸突变增加或降低净正电荷。作为进一步优选，所述增加净正电荷为：通过引入一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变MspA蛋白单体，其特征在于，所述蛋白单体是由野生型MspA蛋白突变所得，所述野生型MspA蛋白包含序列表SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列，所述突变发生在所述序列表SEQ ID NO:1中的88位到116位的区域内的一个或多个氨基酸；所述蛋白单体能够形成八聚体的纳米孔。

【技术特征摘要】
1.一种突变MspA蛋白单体，其特征在于，所述蛋白单体是由野生型MspA蛋白
突变所得，所述野生型MspA蛋白包含序列表SEQIDNO:1中所示氨基酸序列，所述
突变发生在所述序列表SEQIDNO:1中的88位到116位的区域内的一个或多个氨基酸；
所述蛋白单体能够形成八聚体的纳米孔。
2.根据权利要求1所述的突变MspA蛋白单体，其特征在于，所述蛋白单体包含
序列表SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5中所示氨基酸序
列。
3.根据权利要求1所述的突变MspA蛋白单体，其特征在于，所述突变为：所述
一个或多个氨基酸突变增加或减少净正电荷。
4.根据权利要求3所述的突变MspA蛋白单体，其特征在于，所述增加净正电荷
为：通过引入一个或多个带正电的氨基酸和/或中和一个或多个负电荷而增加；或者通过
用一个或多个不带电的氨基酸取代一个或多个带负电的氨基酸而增加；所述减少净正电
荷为：通过用一个或多个不带电的氨基酸取代一个或多个带正电的氨基酸而减少。
5.编码权利要求1-4任一项所述突变MspA蛋白单体的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘全俊，刘航，汪荣亮，吴宏文，谭生伟，谷德健，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32