本发明专利技术属于植物转基因领域，涉及一种快速筛选单拷贝转基因后代纯合家系的方法。利用农杆菌介导的遗传转化方法转化载体，用southern筛选阳性单拷贝转化植株，从T0代转基因株上收种子，播于苗床，取三叶期叶片，CTAB法抽提小样总DNA，以外源目的基因潮霉素和内源G3PDH基因设计real-time PCR引物；利用外源目的基因和內源基因的引物对小样DNA进行real-time PCR，比较计算外源目的基因和內源基因的扩增Ct值来判断转基因株的基因型；T1代结实以后通过发芽再次检测转基因株基因型，比较上述两个转基因株基因型是否吻合，选两个基因型都能吻合材料作为转基因育种或杂交转育或多基因聚合育种材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物转基因
，具体涉及一种快速筛选单拷贝转基因后代纯合家系的方法及应用，所述的应用包括水稻转基因育种、杂交转育育种或多基因聚合育种的应用。
技术介绍
水稻是我国最重要的粮食作物，大约养活我国约60％的人口。自1983年第一例转基因时间发生以来(Zambryskietal.,TiplasmidvectorfortheintroductionofDNAintoplantcellswithoutalterationoftheirnormalregenerationcapacity.EMBOJ,1983,2:2143-2150)，植物基因工程的研究取得了突飞猛进的进展，已经成为现代作物育种过程中一项重要的方法和技术。通过基因工程的手段去改良作物在农业生产中具有良好的应用前景；因此，转基因技术在未来水稻的品种改良和遗传育种过程中也将扮演越来越重的角色(张启发主编，绿色超级稻的构想与实践，科学出版社，2009年版)。在植物转基因育种过程中(包括基因枪和T-DNA介导的遗传转化方法)或者是转基因材料的后期杂交转育以及多基因聚合育种过程中获得的阳性苗及F1杂种一般为杂合状态，因此为了得到稳定遗传的阳性材料，我们往往需要在后代的种植期间筛选出纯合家系，而后再进行性状考察等工作。筛选纯合植株的方法目前有主要有三种，一是在没有获得插入位点的情况下，需要单独繁殖一代，收获以后对种子进行发芽实验，统计后代在抗性基因上面的发芽比例，进而判断该材料是否为纯合家系(Chenetal.,Transgenicindicariceplantsharboringasyntheticcry2A*geneofBacillusthuringiensisexhibitenhancedresistanceagainstlepidopteranricepests.TheorApplGenet,2005,111:1330-1337；Tangetal.,Developmentofinsectresistanttransgenicindicaricewithasyntheticcry1C*gene.MolBreed,2006,18:1-10；Yeetal.,Developmentofinsect-resistanttransgenicricewithCry1C*-freeendosperm.PestManagSci,2009,65:1015-1020)。；二是，分离转基因材料插入位点的侧翼序列，进而在分离群体中检测材料的基因型(Yuanetal.,MutationofthericegenePAIR3resultsinlackofbivalentformationinmeiosis.PlantJ2009,59:303-315)；三是繁殖一代以后利用PCR法检测后代基因型的分离比例，进而判断亲本的基因型(Yangetal.,DevelopmentandcharacterizationoftransgenicriceexpressingtwoBacillusthuringiensisgenes.PestManagSci2011；67:414–422)。但是，上面三种方法都有较大的缺陷，一是发芽实验和PCR方法耗时较长，需要单独花1代来繁殖，筛选；二是发芽实验过程中种子质量及发芽力差异对发芽率影响较大，容易影响判断；三是当培育无筛选标记基因(Markerfree)的转基因材料和多基因聚合(抗性基因相同)时就没有合适抗性基因使用，进而无法进行发芽实验，这时候就必须对后代进行大规模的PCR阳性检测，通过统计阳性比例来判断上代亲本的基因型(Yangetal.,DevelopmentandcharacterizationoftransgenicriceexpressingtwoBacillusthuringiensisgenes.PestManagSci2011；67:414–422)；四是，分离侧翼序列的过程复杂，对DNA的质与量有很高要求，大规模分离插入位点的侧翼序列有很大的难度，不适合在早期大规模筛选(Zhangetal.,Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.PlantJ2007；.47,947–959)。因此如何快速准确检测出转基因植株的基因型，加速水稻转基因育种具有重要意义。本专利技术就是利用有Real-timePCR的方法，在T1代苗期检测家系中各单株目的基因和水稻内源基因的扩增曲线，进而快速筛选出纯合植株。通过本专利技术，可以在T1代利用少量DNA就能方便快速鉴定植株的基因型，加快转基因及聚合育种进程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有筛选纯合植株技术的不足，提供一种快速筛选单拷贝转基因后代纯合家系的方法及应用，本专利技术通过快速，简单地利用微量DNA(浓度约为40ng)在苗期从T1代分离群体中筛选纯合植株，有望将运用于水稻的转基因育种与品种改良。为了便于研究利用，申请人通过农杆菌介导的遗传转化获得20株转基因植株，利用southern杂交的方法验证转化植株的拷贝数，获得1，9和16三个单拷贝植株。利用realtimePCR的方法检测T1代后代苗期植株外源目的基因和水稻內源基因的扩增曲线，筛选纯合植株，从而实现本专利技术的任务。利用本专利技术，可以在水稻苗期利用少量DNA来快速检测目的基因的基因型，筛选纯合植株。专利技术可以解决现有筛选纯合植株方法的主要缺陷，如耗时长和工作量大，加快育种进程。本专利技术的具体技术方案如下所示：一种快速筛选单拷贝转基因后代纯合家系的方法，其特征在于，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化载体pCAMBIA1300，采用southern方法筛选出阳性单拷贝转化植株，从T0代转基因植株上收获种子，通过浸种催芽并播种于苗床上，在三叶苗期取植株上的小样叶片，通过CTAB法抽提小样基因组DNA，以外源目的基因潮霉素基因和水稻内源G3PDH基因的核苷酸序列设计real-timePCR引物；利用所述的外源目的基因和所述的水稻內源基因的引物对小样DNA进行real-timePCR检测，通过比较计算所述的外源目的基因和所述的水稻內源基因的扩增Ct值来判断转基因植株的基因型；在T1代结实以后通过发芽实验再次检测转基因植株的基因型，比较上述两个转基因植株的基因型结果是否吻合，选两个转基因植株的基因型结果都能吻合材料作为后续水稻转基因的育种材料或水稻杂交转育育本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速筛选水稻单拷贝转基因后代纯合家系的方法，其特征在于，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化载体pCAMBIA1300，采用southern方法筛选出阳性单拷贝转化植株，从T0代转基因植株上收获种子，通过浸种催芽并播种于苗床上，在三叶苗期取植株上的小样叶片，通过CTAB法抽提小样基因组DNA，以外源目的基因潮霉素基因和水稻内源G3PDH基因的核苷酸序列设计real‑time PCR引物；利用所述的外源目的基因和所述的水稻內源基因的引物对小样DNA进行real‑time PCR检测，通过比较计算所述的外源目的基因和所述的水稻內源基因的扩增Ct值来判断转基因植株的基因型；在T1代结实以后通过发芽实验再次检测转基因植株的基因型，比较上述两个转基因植株的基因型结果是否吻合，选两个转基因植株的基因型结果都能吻合材料作为后续水稻转基因的育种材料或水稻杂交转育育种材料或水稻多基因聚合育种材料；其中，所述的潮霉素基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的G3PDH基因的核苷酸序列序列表SEQ ID NO:2所示；所述引物的核苷酸序列如下所示：潮霉素基因引物F：CTGATAGAGTTGGTCAAGAC潮霉素基因引物R：TACATGGCGTGATTTCATATG3PGH基因引物F：TTACATCTCTAGTCTCTTATGG3PGH基因引物R：CTGGAACATTTATCTACCTAPCR程序如下所示：94℃10sec；94℃5sec，60℃34sec，45个循环。...
【技术特征摘要】
1.一种快速筛选水稻单拷贝转基因后代纯合家系的方法，其特征在于，利用农杆菌介导的遗传转化
方法转化载体pCAMBIA1300，采用southern方法筛选出阳性单拷贝转化植株，从T0代转基因植株上收获
种子，通过浸种催芽并播种于苗床上，在三叶苗期取植株上的小样叶片，通过CTAB法抽提小样基因组
DNA，以外源目的基因潮霉素基因和水稻内源G3PDH基因的核苷酸序列设计real-timePCR引物；利用所
述的外源目的基因和所述的水稻內源基因的引物对小样DNA进行real-timePCR检测，通过比较计算所述
的外源目的基因和所述的水稻內源基因的扩增Ct值来判断转基因植株的基因型；在T1代结实以后通过发
芽实验再次检测转基因植株的基因型，比较上述两个转基因植株的基因型结果是否吻合，选两个转基因植
株的基因型结果都能吻合材料作为后续水稻转基因的育种材料或水稻杂交转育育种材料或水稻多...
【专利技术属性】
技术研发人员：林拥军，陈太钰，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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