一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针和对细胞内钙离子检测的钙离子荧光探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。本发明专利技术还公开了一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法在检测藤黄酸心脏毒性的应用。本发明专利技术具有低浓度、快速、高通量、低成本、高准确性的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物毒性检测领域，具体涉及一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法及其应用。
技术介绍
现今心血管疾病的防治卓有成效，癌症成为了医学界的首要难题。肿瘤患者在化疗治疗过程中却冒着心血管病情恶化的风险。过去肿瘤疾病极大地缩小了患者的寿命，以致人们忽略了心脏并发症。现在早期诊断和治疗的介入、靶向药物的发现和使用，使得由癌症治疗引起的心脏毒性成为重点关注问题。蒽环类药物如阿霉素(Doxorubicin，Dox)和柔红霉素等，对心肌的主要毒性反应的细胞表征为诱导细胞死亡，线粒体DNA损伤，线粒体功能失常以及胞内钙稳态失衡。蒽环类药物在临床使用中因出现严重心脏毒性反应而被撤市或限制使用。ABL抑制剂如伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼等通过激活内质网的压力反应诱导心肌细胞凋亡。另一类产生心脏毒性的药物为治疗心脏疾病的药物，如第三类治疗心律失常药盐酸胺碘酮(Amiodarone，Ami)，已被FDA列入心脏毒性的名单中。因此药物的临床前心脏毒性安全性评价及预测不仅减少不必要的经济和资源的浪费，而且也可为安全用药提供实验数据支持。藤黄(Gamboge)为藤黄科植物藤黄树(GarciniahanbaryiHook.f.)分泌的干燥树脂，其中藤黄酸是其主要有效成分。藤黄酸已被开发为一种广谱抗肿瘤药，对多种肿瘤有显著疗效，如对人肝癌细胞株的增殖有明显的抑制作用，还可明显抑制胃腺癌细胞株的增殖。藤黄酸可通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期进程、抑制癌细胞转移和抑制血管生成等多方面机制达到抗癌效果。现有安全性评价研究表明，藤黄酸具有肾毒性和肝毒性。藤黄酸为具潜力的抗癌药物，其心脏毒性的评价也是必要的。心脏毒性可以发展为急性、亚急性和慢性疾病。临床上急性和亚急性心脏毒性的特点为心室负极化的异常表现、QT间期延长、室上性以及室性心律失常。慢性心脏毒性表现为心脏无症状收缩和左心室舒张功能异常。细胞水平的急性心脏毒性则表现为心肌细胞迅速死亡。但是在较温和的环境刺激下形成的早期应答反应是胞内钙稳态的失衡，但这个过程是可逆的。如果心脏受到长期的毒性刺激，则诱发心肌肥厚，进而导致不可逆的心肌病，最终将使患者心力衰竭。心力衰竭是心肌细胞大量死亡造成的结果，其中包括细胞凋亡和坏死。导致心肌死亡的分子通路有很多，包括细胞因子的活化、线粒体诱导细胞凋亡、胞内Ca2+超载及MAPK的活化等通路。心脏毒素以多种方式影响心肌细胞行为和表型，包括干扰线粒体呼吸、细胞膜通透性以及诱发细胞死亡通路。为了同时检测多种毒性指标，高内涵提供了一个灵敏精确的方法来检测这些指标在细胞表型的微弱变化。但是这些变化却不被电生理或其他传统的体外方法所发现。虽然体内模型仍然是最被广泛认可的检测方法，但是存在低通量，高投入的弊端，并且对人体的生理反应的预测能力有限，这导致动物模型在毒理学研究中的应用减少，而高内涵细胞影像技术则越来越被重视和应用。此外，以细胞活力、线粒体完整性及活性氧的生成量为指标的高内涵检测方法等都得到了业界的认可和应用。
技术实现思路
基于上述现有技术中存在的问题，本专利技术设计开发了一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，目的是通过高内涵检测技术应用于心脏毒性的评价，基于细胞表型心脏毒性多指标同步量化表征方法，在保持细胞结构和功能完整的前提下同时对多个指标进行检测，具有低浓度、快速、高通量、低成本、高准确性的特点。本专利技术还设计开发了一种基于细胞表型的高内涵多指标心脏毒性的检测方法的应用，针对藤黄酸在心脏毒性检测的应用，从而为更为快速、准确、经济、有效的评价广谱抗癌药藤黄酸的心脏毒性，并且对其用药安全性提供更多的可能。本专利技术提供的技术方案为：一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针和对细胞内钙离子检测的钙离子荧光探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。优选的是，所述待测药物包括：阿霉素、胺碘酮及次乌头碱，计算在检测浓度为0.014～10μmol·L-1范围内对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响。优选的是，所述待测药物样本用二甲基亚砜溶解并配成10mmol·L-1的母液，配置于离心管中，-20℃密封保存，细胞给药时用DMEM高糖培养基溶解稀释。优选的是，所述细胞为H9c2细胞，其用含10％胎牛血清、含青霉素100kU·L-1、链霉素100mg·L-1以及pH7.2的DMEM高糖培养基培养，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中，隔天弃去原培养基，加入2mL胰蛋白酶-EDTA消化传代。优选的是，所述荧光分子探针为Hoechst33342或MitotrackerDeepRedFM，所述钙离子荧光探针为Rhod2AM或Fluo4AM；在所述成像分析时，使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成像，或者使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Fluo4AM通道进行活细胞成像。优选的是，检测所述药物对细胞的影响时，针对阿霉素及胺碘酮，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体质量及细胞内钙离子浓度，考察药物对细胞的影响，针对次乌头碱，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。优选的是，所述高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括：细胞接种于孔板之后，收集对数生长期细胞，以每孔5000个细胞浓度加入96孔黑色透明底的培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，换入所述待测药物，培养24h，换成含有0.1μmol·L-1的Hoechst33342和MitoTrackerDeepRedFM两种染料的DMEM高糖培养基，避光孵育20min，换成含有3μmol·L-1Fluo4AM或Rhod2AM的DMEM高糖培养基，避光培养30min；对阿霉素及胺碘酮使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Fluo4AM通道进行活细胞成像，对图像进行采集，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体质量及细胞内钙离子浓度，考察药物对细胞的影响，对次乌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，其特征在于，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针和对细胞内钙离子检测的钙离子荧光探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，其特征在于，包
括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针和
对细胞内钙离子检测的钙离子荧光探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系
统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成
像分析，得出所述待测药物对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体
的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。
2.如权利要求1所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，
其特征在于，所述待测药物包括：阿霉素、胺碘酮及次乌头碱，计算在检测
浓度为0.014～10μmol·L-1范围内对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线
粒体的至少一种影响。
3.如权利要求1或2所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方
法，其特征在于，所述待测药物样本用二甲基亚砜溶解并配成10mmol·L-1的
母液，配置于离心管中，-20℃密封保存，细胞给药时用DMEM高糖培养基
溶解稀释。
4.如权利要求3所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，
其特征在于，所述细胞为H9c2细胞，其用含10％胎牛血清、含青霉素
100kU·L-1、链霉素100mg·L-1以及pH7.2的DMEM高糖培养基培养，置于
37℃，5％CO2恒温培养箱中，隔天弃去原培养基，加入2mL胰蛋白酶-EDTA
消化传代。
5.如权利要求3所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，
其特征在于，所述荧光分子探针为Hoechst33342或MitotrackerDeepRedFM，
所述钙离子荧光探针为Rhod2AM或Fluo4AM；在所述成像分析时，使用
Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成
像，或者使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Fluo4AM通道
进行活细胞成像。
6.如权利要求5所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，
其特征在于，检测所述药物对细胞的影响时，针对阿霉素及胺碘酮，计算细

\t胞存活率、细胞核面积、线粒体质量及细胞内钙离子浓度，考察药物对细胞
的影响，针对次乌头碱，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒
体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
7.如权利要求1、2、4-6中任一项所述的基于细胞表型的多指标量化心
脏毒性...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱彦，王萌，祝婕，崔英，任晓亮，刘洋，樊官伟，高秀梅，王晓明，张鹏，姜苗苗，张慧杰，谭乐俊，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：天津;12