同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用。首次揭示一种特别适合于诊断人乳头瘤病毒的分型和检测方法，所述检测方法经过合理的设计，适用于目前被广泛应用的四通道实时荧光定量PCR仪，不仅可以同时检测多种高危型病毒，而且检测程序简单易操作。本发明专利技术人还优化了PCR扩增反应程序，进一步提高了扩增效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒诊断领域，更具体地，本专利技术涉及一种同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用。
技术介绍
宫颈癌是全球妇女中发病率仅次于乳腺癌的最常见的恶性肿瘤，世界范围内每年约有50万的宫颈癌新发病例。通过宫颈筛查可以将宫颈癌的发病率大大降低。大量的流行病学和分子生物学研究证明人乳头瘤病毒(HumanPapillomaVirus，HPV)感染是宫颈癌和癌前病变发生的主要因素：世界卫生组织曾经在22个国家进行的调查结果显示，有99.9％的宫颈癌患者可以检测到HPV感染；国际癌症研究协会(IARC)1995年宣布HPV感染是宫颈癌的主要病因。人乳头瘤病毒是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒。目前已分离出130多种，约有30多种可以感染人的生殖道黏膜。大量的科学研究发现，HPV基因型不同，其致癌力、宫颈癌病理分型以及宫颈癌的预后均有所不同。根据HPV感染人生殖道黏膜后的致癌性不同将其分为高危和低危两大类别，低危型包括6、11、54、40、42、43和44等，以6和11最为常见；高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73和83等，其中以16和18最为常见。目前WHO及IRAC确认的14种致宫颈癌的高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68。对HPV进行分型检测可以预测受检者的发病风险度，决定其筛查间隔；更可以区分持续感染和一过性感染，以便及早进行治疗，以降低发生率和死亡率；用于手术后的追踪，确定是否将病灶清除干净，便于治疗后的随访；指导HPV疫苗的研究及使用。HPV的检测技术发展很快，出现了很多HPV检测技术，大致可分为以下几种：(1)细胞学检查，如传统巴氏涂片(CV)、液基薄层细胞学技术(TCT)、计算机辅助细胞检查系统，此类技术操作简单、价格低廉、适宜作初步筛查，但应用细胞病理学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、且无法进行HPV分型检测；(2)感染组织中HPV蛋白的检测，针对HPV抗原(主要是衣壳蛋白制备抗体)通过免疫学方法进行检测，如ELISA、免疫沉淀法等，此类方法原理明确、操作简单，但由于HPV至今尚不能在体外培养，且其免疫原型较弱，导致血清学方法检测灵敏度低；(3)HPV基因组检测，如Southern杂交法、原位杂交法、杂交捕获法、以及PCR类检测方法。Southern杂交法是应用酚氯仿提取纯化DNA，通过限制酶消化、电泳、变性、转膜和放射性标记探针杂交鉴定HPV亚型。此法是以杂交片段大小与杂交的严格性为基础，具有较好的灵敏度，但也具有耗费人力、试验步骤复杂和使用放射性探针等缺点。原位杂交法应用组织或细胞在病理切片上和分子探针进行HPVDNA杂交，既可观察组织学形态变化，又可检测HPV表达的状况，是理想的病理学检测及研究方法。目前国内尚缺乏稳定的探针，只可分为高危、低危型，操作较复杂，不适于大规模普查。杂交捕获法原理是利用对抗体捕获信号放大和化学发光的检测。此为经美国FDA认证后用于30岁以上女性宫颈癌的初筛方法，仅用于细胞学标本，是国内妇科学会指定的检查方法。第二代杂交捕获法可检测13种高危型HPV。此种方法具有良好的灵敏度和特异性，但其存在交叉污染、费用昂贵、且不便于HPV分型等缺点。PCR类检测方法不仅可以对HPV阳性感染进行确诊，还可以进行HPV分型，不足之处是一次反应检测的型别相对较少，尚难做到高通量分型检测。此类方法还需要找到合适的引物和/或探针，当进行多种亚型病毒共同检测时，往往由于引物条数较多，易于发生非特异性结合导致灵敏度降低，因此其对于检测试剂要求很高。目前，本领域中存在一些用荧光PCR检测HPV病毒的试剂盒，如中山大学达安基因股份有限公司的高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒(可检测9种HPV基因型，HPV16、18、31、33、45、52、56、58、67)。但是，这些试剂盒的试剂均仅基于L1区序列进行引物设计，这与人们对HPV的认知是相符的，因为L1区具有高度特异性。然而真是由于L1区的高度特异性导致了这些试剂盒存在不足，若想用一次PCR反应同时检测多种基因型，则需多对引物和多条探针，然而一个PCR反应中若引物和探针过多则会影响PCR反应的效率，严重影响检测试剂盒的特异性和灵敏度。因此中山大学达安基因股份有限公司仅能检测9种HPV病毒且仅能对HPV16和HPV18分型。综上，本领域还需要进一步开发检测效果更为理想的HPV检测和分型试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种同时对6种以上人乳头瘤病毒进行分型及检测的方法，所述方法包括：(1)根据待测人乳头瘤病毒型别，分别提供特异性的扩增引物和检测探针：(a)针对第1种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对1和检测探针1，该检测探针1连接荧光标记1，(b)针对第2种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对2和检测探针2，该检测探针2连接荧光标记2，(c)针对第3种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对3和检测探针3，该检测探针3连接荧光标记3，(d)针对第4种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对4和检测探针4，该检测探针4连接荧光标记1或荧光标记5，(e)针对第5种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对5和检测探针5，该检测探针5连接荧光标记2或荧光标记6，(f)针对第6-X种人乳头瘤病毒，分别提供各自的特异性引物对6～X和检测探针6～X，该检测探针6～X连接荧光标记3或荧光标记7，其中，X为7～100的正整数(如10、20、30、40、50、60、80)；并且，提供(g)针对内参照的特异性引物对0和检测探针0，该检测探针连接荧光标记4；其中，荧光标记1～7是不同的；(2)提供PCR反应管1和2，在反应管1中，加入(a)～(c)以及(g)的引物对和探针；在反应管2中，加入(d)～(f)以及(g)的引物对和探针；反应管1和2中还包括PCR反应试剂(如MgCl2、热启动Taq酶、dNTP、PCR反应缓冲液等)；(3)将待测样本加入到(2)的反应管1和2中，通过四通道实时荧光定量PCR仪分别检测，分别得出反应管1和反应管2的荧光信号，从而实现第1种～第5种人乳头瘤病毒的分型和第6～X种人乳头瘤病毒的检测(即：不分型的检出)。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时对6种以上人乳头瘤病毒进行分型及检测的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)根据待测人乳头瘤病毒型别，分别提供特异性的扩增引物和检测探针：(a)针对第1种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对1和检测探针1，该检测探针1连接荧光标记1，(b)针对第2种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对2和检测探针2，该检测探针2连接荧光标记2，(c)针对第3种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对3和检测探针3，该检测探针3连接荧光标记3，(d)针对第4种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对4和检测探针4，该检测探针4连接荧光标记1或荧光标记5，(e)针对第5种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对5和检测探针5，该检测探针5连接荧光标记2或荧光标记6，(f)针对第6‑X种人乳头瘤病毒，分别提供各自的特异性引物对6～X和检测探针6～X，该检测探针6～X连接荧光标记3或荧光标记7，其中，X为7～100的正整数；并且，提供(g)针对内参照的特异性引物对0和检测探针0，该检测探针连接荧光标记4；其中，荧光标记1～7是不同的；(2)提供PCR反应管1和2，在反应管1中，加入(a)～(c)以及(g)的引物对和探针；在反应管2中，加入(d)～(f)以及(g)的引物对和探针；反应管1和2中还包括PCR反应试剂；(3)将待测样本加入到(2)的反应管1和2中，通过四通道实时荧光定量PCR仪分别检测，分别得出反应管1和反应管2的荧光信号，从而实现第1种～第5种人乳头瘤病毒的分型和第6～X种人乳头瘤病毒的检测。...

【技术特征摘要】
1.一种同时对6种以上人乳头瘤病毒进行分型及检测的方法，其特征在于，所
述方法包括：
(1)根据待测人乳头瘤病毒型别，分别提供特异性的扩增引物和检测探针：
(a)针对第1种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对1和检测探针1，该检测探
针1连接荧光标记1，
(b)针对第2种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对2和检测探针2，该检测
探针2连接荧光标记2，
(c)针对第3种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对3和检测探针3，该检测探
针3连接荧光标记3，
(d)针对第4种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对4和检测探针4，该检测
探针4连接荧光标记1或荧光标记5，
(e)针对第5种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对5和检测探针5，该检测探
针5连接荧光标记2或荧光标记6，
(f)针对第6-X种人乳头瘤病毒，分别提供各自的特异性引物对6～X和检测
探针6～X，该检测探针6～X连接荧光标记3或荧光标记7，其中，X为7～
100的正整数；
并且，提供(g)针对内参照的特异性引物对0和检测探针0，该检测探针连接
荧光标记4；
其中，荧光标记1～7是不同的；
(2)提供PCR反应管1和2，在反应管1中，加入(a)～(c)以及(g)的引物对和探
针；在反应管2中，加入(d)～(f)以及(g)的引物对和探针；反应管1和2中还包括
PCR反应试剂；
(3)将待测样本加入到(2)的反应管1和2中，通过四通道实时荧光定量PCR仪
分别检测，分别得出反应管1和反应管2的荧光信号，从而实现第1种～第5种人
乳头瘤病毒的分型和第6～X种人乳头瘤病毒的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光标记1～7分别选自：
VIC荧光基团；ROX荧光基团；FAM荧光基团；Cy5荧光基团；HEX荧光基团；TET
荧光基团；JOE荧光基团；NED荧光基团；TAMRA荧光基团。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人乳头瘤病毒是高危型人乳

\t头瘤病毒；较佳地，所述的高危型人乳头瘤病毒是HPV16、18、31、33、35、39、
45、51、52、56、58、59、66、68；较佳地，所述的第1种～第5种人乳头瘤病毒
是HPV16、18、52、33、58，所述的第6-X种人乳头瘤病毒是HPV31、35、39、45、
51、56、59、66、68；较佳地，所述的内参照是β-Globin。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，针对HPV16型的引物对序列是SEQ
IDNO:15和SEQIDNO:16；探针序列是SEQIDNO:45；
针对HPV18型的引物对序列是SEQIDNO:17和SEQIDNO:18；探针序列是
SEQIDNO:46；
针对HPV52型的引物对序列是SEQIDNO:19和SEQIDNO:20；探针序列是
SEQIDNO:47；
针对HPV33型的引物对序列是SEQIDNO:21和SEQIDNO:22；探针序列是
SEQIDNO:49；
针对HPV58型的引物对序列是SEQIDNO:23和SEQIDNO:24；探针序列是
SEQIDNO:48；
针对HPV31型的引物对序列是SEQIDNO:26和SEQIDNO:27；
针对HPV35型的引物对序列是SEQIDNO:28和SEQIDNO:29；
针对HPV39型的引物对序列是SEQIDNO:30和SEQIDNO:31；
针对HPV45型的引物对序列是SEQIDNO:32和SEQIDNO:33；
针对HPV51型的引物对序列是SEQIDNO:34和SEQIDNO:35；
针对HPV56型的引物对序列是SEQIDNO:36和SEQIDNO:37；
针对HPV59型的引物对序列是SEQIDNO:38和SEQIDNO:39；
针对HPV66型的引物对序列是SEQIDNO:40和SEQIDNO:41；
针对HPV68型的引物对序列是SEQIDNO:42和SEQIDNO:31；
针对β-Globin的引物对序列是SEQIDNO:43和SEQIDNO:44；探针序列是
SEQIDNO:25。
5.如权利要求1所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：白艳军，胡可，姚见儿，
申请(专利权)人：上海透景生命科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31