酸性α-葡糖苷酶中反义诱导的外显子2纳入制造技术

本发明专利技术涉及反义寡核苷酸和相关的组合物以及用于诱导的外显子纳入作为治疗II型糖原贮积病(GSD‑II)(也称为庞帕病、II型糖原病、酸麦芽糖酶缺乏(AMD)、酸性α‑葡糖苷酶缺乏，和溶酶体α‑葡糖苷酶缺乏)的方法，并且更具体地涉及诱导外显子2的纳入并由此恢复由GAA基因编码的酶促活性酸性α‑葡糖苷酶(GAA)蛋白的水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】酸性α-葡糖苷酶中反义诱导的外显子2纳入相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年9月5日提交的美国申请号61/874,261和2014年1月27日提交的美国申请号61/932,195的优先权；其全文各自通过引用纳入本文。关于序列表的声明与本申请相关的序列表以文本形式代替纸质版提供，并且因此通过引用纳入说明书。包含序列表的文本文件的名称为SATH_001_02WO_ST25.txt。该文本文件为约62KB，其在2014年9月5日生成，并且通过EFS-Web电子提交。背景专利
本专利技术涉及反义寡聚体和相关的组合物以及用于诱导的外显子纳入作为对II型糖原贮积病(GSD-II)(也称为庞帕病、II型糖原病、酸麦芽糖酶缺乏(AMD)、酸性α-葡糖苷酶缺乏和溶酶体α-葡糖苷酶缺乏)的治疗的方法，并且更具体地涉及诱导外显子2的纳入并由此恢复由GAA基因编码的酶促活性酸性α-葡糖苷酶(GAA)蛋白的水平。相关领域描述可变剪接通过从单一基因产生多个蛋白质增加了人基因组的编码潜力。不合适的可变剪接也与不断增加的人类疾病相关。GSD-II是一种由称为酸性α-葡糖苷酶(GAA)的酶的缺乏所导致的遗传常染色体隐性溶酶体贮积症。GAA在体内的作用是降解糖原。GAA活性水平的降低或缺失导致糖原在受影响的组织，包括心脏、骨骼肌(包括参与呼吸的那些)、肝脏和神经系统中积累。这种糖原积累被认为在患有GSD-II的个体中导致进行性肌无力和呼吸功能不全。GSD-II可发生于婴儿、小儿或成人，并且其预后根据发作的时间和症状的严重性而变化。临床上，GSD-II可能以广泛且连续的严重谱产生影响，范围从严重(婴儿)到较温和的迟发成人形式。患者最终由于呼吸功能不全而死亡。疾病的严重性与残留的酸性α-葡糖苷酶活性之间有良好的相关性，该活性在迟发中是正常情况的10-20％并且在疾病的早发形式中不到2％。估计GSD-II在全世界影响大约5000至10000人。与疾病的成人发生形式相关的最常见突变是IVS1-13T＞G。在三分之二的成人发生的GSD-II患者中发现，这种突变可能在杂合个体中赋予选择性优势或者是非常老的突变。带有这种突变的成人发生的GSD-II个体的广泛族群变化与常见发现对立。GAA基因由跨20kb的20个外显子组成。3.4kbmRNA编码大约105kD的分子量的蛋白。IVS1-13T＞G突变导致丢失外显子2(577个碱基)，其含有起始AUG密码子。对GSD-II的治疗已经包括药物治疗策略、饮食处理，和骨髓移植，而没有明显成功。近年来，酶替换疗法(ERT)已向GSD-II患者提供新的希望。例如，一种重组GAA蛋白药物，在2006年在美国和欧洲得到批准用于患有GSD-II疾病的患者。依赖于GAA蛋白表面上的甘露糖-6-磷酸(M6P)来递送至溶酶体。最常用于RNA下调的反义技术(antisensetechnology)近来已经适用于改变剪接过程。对许多基因的主要基因转录本(前体mRNA)的处理包括去除内含子和精确剪接外显子，其中供体剪接位点联接至受体剪接位点。剪接是一个精确的处理过程，包括配位识别供体和受体剪接位点，以及分支点(受体剪接位点上游)和其余的正外显子剪接增强子(主要位于外显子内)和负剪接基序(主要位于内含子内的剪接沉默子)。能够改变GAA前体mRNA的剪接的有效试剂可能在治疗上用于GSD-II的改善的治疗。概述本专利技术的实施方式涉及反义寡聚体以及相关的组合物和用于增加细胞中含外显子2的GAA-编码mRNA的水平的方法，包括将该细胞与具有足够的长度和互补性以足以特异性地杂交GAA基因的前体mRNA内的区的反义寡聚体接触，其中反义寡聚体与该区的结合增加了细胞中含外显子2的GAA-编码mRNA的水平。因此，在一些实施方式中，本专利技术涉及10-40个核苷酸或核苷酸类似物的反义寡聚体，包括具有足够的长度和互补性以足以特异性杂交人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQIDNO：1)、外显子2(SEQIDNO：2)或内含子2(SEQIDNO：3)内的区的靶向序列。在某些实施方式中，本专利技术涉及反义寡聚体化合物，包含：非天然化学主链，其选自氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-修饰的寡聚体，或前述的任意组合；和与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQIDNO：1)、内含子2(SEQIDNO：2)，或外显子2(SEQIDNO：3)内的区互补的靶向序列。在一些实施方式中，反义寡聚体特异性杂交表1所列的内含子1、外显子2、和/或内含子2GAA序列内的区。在一些实施方式中，反义寡聚体特异性杂交内含子剪接沉默子元件或外显子剪接沉默子元件。在某些实施方式中，反义寡聚体包含表2所列的靶向序列、表2中靶向序列的至少10个连续核苷酸的片段，或与表2中的靶向序列有至少80％序列相同性的变体。在具体实施方式中，反义寡聚体由表2所列的靶向序列组成或基本由其组成。在某些实施方式中，反义寡聚体是氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、PMO-X、PPMO、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-修饰的寡聚体，或前述的任意组合。在一些实施方式中，反义寡聚体含有约、至少约，或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个阳离子核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡聚体含有约，或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％阳离子核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡聚体含有约、至少约，或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷间连接，其显示出约4.5至约12的pKa。在一些实施方式中，反义寡聚体含有约，或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％核苷间连接，其显示出约4.5至约12的pKa。在一些实施方式中，反义寡聚体具有同时含有碱性氮和烷基、芳基或芳烷基的核苷间连接。在一些实施方式中，反义寡聚体包含吗啉基。在某些实施方式中，本专利技术的反义寡聚体是式(I)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；x是8-38的整数；各Y独立地选自O或-NRa，其中Ra选自氢、-T1-NRcRdRe和-[(C(O)CHR′NH)m]R″，其中：R′是天然产生的氨基酸或其一个或两个碳的同系物的侧链，R″选自氢或酰基，m是1-60的整数，Rc选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，Rd选自氢、芳烷基和C本文档来自技高网...

【技术保护点】
10‑40个核苷酸或核苷酸类似物的反义寡聚体化合物，所述化合物包含：非天然化学主链，其选自氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环‑DNA寡聚体、三环‑硫代磷酸酯寡聚体、2’O‑Me‑硫代磷酸酯寡聚体，或前述的任意组合；和与人酸性α‑葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ ID NO：1)、内含子2(SEQ ID NO：2)、或外显子2(SEQ ID NO：3)内的区互补的靶向序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.05 US 61/874,261;2014.01.27 US 61/932,1951.10-40个核苷酸或核苷酸类似物的反义寡聚体化合物，所述化合物包含：
非天然化学主链，其选自氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-硫代磷酸酯寡聚体，或前述的任意组合；和
与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQIDNO:1)、内含子2(SEQIDNO:2)、或外显子2(SEQIDNO:3)内的区互补的靶向序列，其中，所述靶向序列选自SEQIDNO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。


2.一种式(I)的化合物：



或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；
x是8-38的整数；
各Y独立地选自O或–NRa，其中Ra选自氢、-T1-NRcRdRe和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中：
Rc选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，
Rd选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者
当RC和Rd各自独立地是C1-C6烷基或芳烷基时，Rc和Rd与其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中所述环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且
Re选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各L独立地选自

和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中w是3-20的整数，并且S是1-8的整数；
n是0-3的整数；
各R1独立地选自-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7、
式(II)的部分：



其中：
R8选自氢、甲基、-C(＝NH)NH2、-Z-T2-NHC(＝NH)NH2和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中Z是羰基或直接键，
R9选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各R10独立地选自氢或甲基；和
式(III)的部分：



其中：
q是0-2的整数，
R11选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，
R12选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者
R11和R12与其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中所述环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且
R13选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
R2选自氢、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg，其中Rf和Rg独立地选自H、酰基、C1-C6烷基和–[(C(O)CHR’NH)m]R”、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(＝O)ORf和酰基，其中Rf是C1-C30烷基，其包含一个或多个氧或羟基部分或其组合，或R2不存在；
R3选自氢、C1-C6烷基、核苷酸、–[(C(O)CHR'NH)m]R”、-C(＝NH)NH2、三苯甲基、-C(＝O)ORg、酰基、-C(O)(CH2)mC(O)和T4-(4-(4,6-(NR2)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基，，其中Rg是包含一个或多个氧或羟基部分或其组合的C1-C30烷基，
T4选自–C(O)(CH2)6C(O)-或–C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，且R是–(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2；
R4选自电子对、氢、C1-C6烷基和酰基；
R5独立地选自氢或甲基；
R6和R7独立地选自氢或–T3-NRcRdRe；并且
各T1、T2、和T3独立地是长度至多为18个原子的任选接头，包括烷基、烷氧基或烷氨基，或其组合，
其中，在-[(C(O)CHR'NH)m]R”中：
R'是天然产生的氨基酸或其一个或两个碳的同系物的侧链，
R”选自氢或酰基，
m是1-60的整数，
其中，所述靶向序列与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQIDNO:1)、内含子2(SEQIDNO:2)或外显子2(SEQIDNO:3)内的区互补，其中，所述靶向序列选自SEQIDNO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。


3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，各Nu独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基-修饰的嘧啶，和9-(氨基乙氧基)吩噁嗪。


4.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，各R1是-N(CH3)2。


5.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述至少一个R1选自下组：





6.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，50-90％的所述R1基团是-N(CH3)2。


7.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，66％的所述R1基团是-N(CH3)2。


8.如权利要求2所述的化合物，其特征在于：
n是2；
R2和L一起是下式：

以及
每次出现的Y是O。


9.一种式(IV)的化合物：



或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；
x是15-25的整数；
各Y是O；
各R1独立地选自下组：



其中，至少一个R1是–N(CH3)2，并且
其中，所述靶向序列选自SEQIDNO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。


10.一种药物组合物，其包含10-40个核苷酸或核苷酸类似物的反义寡聚体化合物和药学上可接受的运载体，所述化合物包含：
非天然化学主链，其选自氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-硫代磷酸酯寡聚体，或前述的任意组合；和
与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQIDNO:1)、内含子2(SEQIDNO:2)或外显子2(SEQIDNO:3)内的区互补的靶向序列，其中，所述靶向序列选自SEQIDNO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。


11.一种药物组合物，其包含式(I)的化合物：



或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
x是8-38的整数；
各Y独立地选自O或–NRa，其中Ra选自氢、-T1-NRcRdRe和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中：
Rc选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，
Rd选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者
当Rc和Rd各自独立地是C1-C6烷基或芳烷基时，Rc和Rd与其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中所述环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且
Re选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各L独立地选自

和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中w是3-20的整数，并且S是1-8的整数；
n是0-3的整数；
各R1独立地选自-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7，
式(II)的部分：



其中：
R8选自氢、甲基、-C(＝NH)NH2、-Z-T2-NHC(＝NH)NH2和–[...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·D·威尔顿，S·弗莱切，G·J·汉森，R·K·贝司维克，
申请(专利权)人：萨罗塔治疗公司美国，莫道克大学，
类型：发明
国别省市：美国;US