结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒。[课题]由于用于检测结核菌群的常规方法需要时间长且还需要大量劳力和费用，因此还不能进行结核病的确定诊断和早期治疗开始。已存在对快速检测方法的需求。即使对于从生物样品直接检测，如果生物样品中不存在MPT64或仅存在非常少量的MPT64，也不能进行检测。结果已产生结核菌群感染被忽略的风险，并且更可靠的检测方法十分必要。[解决方法]提供一种方法和试剂盒，其中加热处理施加至含有结核菌群的生物样品，从而使结核菌群特异的分泌蛋白质，特别是MPB64，分泌到细菌细胞外，并将得到的处理样品进行免疫学测定，从而在不培养生物样品的情况下以更迅速且简便的方式检测结核菌群。

【技术实现步骤摘要】
结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒本申请是2014年10月8日进入中国的申请号为201380018968.0(PCT/JP2013/060301，国际申请日2013年4月4日)的专利申请“结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒”的分案申请。
本专利技术涉及高度安全的结核菌群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)的免疫学检测方法和试剂盒，其通过在预定的温度下加热处理生物样品并免疫学检测由此被细胞外分泌(extracellularlysecreted)的结核菌群特异的分泌蛋白质，可在不进行培养操作的情况下由含有结核菌群的生物样品直接简便且迅速地进行。
技术介绍
结核(Tuberculosis)为目前高度重要的传染病，据称每年日本国内有数千人、世界各地有数百万人死于该疾病，根据传染病法(InfectiousDiseaseLaw)疑似结核感染的患者必须入院。当诊断患者患有结核时医师必须立即报告给当局，因而需要及时的响应。属于结核菌群的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，人型结核菌)、牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis，牛型结核菌)、鼠结核分枝杆菌(Mycobacteriummicroti，鼠型结核菌)和非洲结核分枝杆菌(Mycobacteriumafricanum，非洲型结核菌)已知为对人类致病的抗酸菌(acid-fastbacteria)。鸟结核分枝杆菌(Mycobacteriumavium)、堪萨斯结核分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)和海鱼结核分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)等已知为非结核性分枝杆菌(non-tuberculousmycobacteria)。感染有结核菌群的人类主要由结核分枝杆菌引起，在某些罕见病例中，由牛结核分枝杆菌引起。近年来，非结核性分枝杆菌种中，感染有鸟结核分枝杆菌的病例增加。由于这两类感染存在类似的临床症状，病因细菌的鉴定对于确定治疗方针也是重要的。因此，结核感染或非结核性分枝杆菌感染的区别检测对于减轻患者负担和适当地进行早期治疗同样是重要的。在另一方面，从公共卫生的角度，区别检测对于防止第三人继发感染的目的也是重要的。迄今为止，作为检测结核菌群的方法，已实施了基于培养的检测方法。此类培养方法通过将待试验的生物样品接种至液体培养基或固体培养基并检测生长的细菌细胞来进行。尽管使用液体培养基的方法可缩短待试验的生物样品的培养期，但该方法在操作期间具有继发感染的高风险，因而需要高度安全的设备和装置。使用固体培养基的方法需要长达大约2个月的时间才能获得检测结果。结核菌群必须使用高度安全的装置在高度安全的环境中特别小心地培养以防止继发感染。作为用于从上述培养的生物样品的培养基中鉴定结核菌群的方法，已知涉及免疫学测定分泌至培养基中的结核菌群特异的蛋白质的简便检测方法。日本专利特开平11-108931号公报公开了用于检测结核菌群存在的方法，该方法包括：将从结核病患者收集的生物样品接种至固体培养基或液体培养基，培养结核菌群数日至数周；然后免疫学检测分泌至培养基中的结核菌群特异的分泌蛋白质MPB64。根据该文献，该方法与常规方法相比允许在培养后立即鉴定和检测结核菌群并减少操作期间继发感染的风险。然而，该方法涉及培养包含在生物样品中的结核菌群，并使用得到的培养物作为样品。因此，该方法需要与直至结核菌群被检测和鉴定的培养期几乎相同的时间，因而需要大量劳力和费用。如日本专利特开平11-108931号公报所述，MPB64为牛结核分枝杆菌BCG(M.bovisBCG)产生并被细胞外分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质。MPT64为结核分枝杆菌产生并被细胞外分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质。MPB64和MPT64已知为相同的物质。日本专利特开2002-62299号公报指出，结核菌群特异的分泌蛋白质MPT64可在不培养包含在生物样品中的结核菌群的情况下通过免疫学测定来检测。该方法涉及处理生物样品如痰并检测包含在生物样品中的MPT64，从而检测结核菌群的存在。然而，即使结核菌群存在于生物样品中，除非MPB64由结核菌群被细胞外分泌并包含在生物样品中，否则该方法也不能检测出结核菌群。另外，丰度小的MPT64，即使分泌也需要大量的生物样品并使操作复杂化。该操作增加了试验对象和负责试验人员的负担。同时，可能会忽略结核菌群的感染，导致公共卫生问题。国际公开WO2009/084481号公开了一种更快速、更安全且比以往更精确地诊断结核菌感染的方法，该方法包括使用抗MPB64中特定表位的抗体特异地检测生物样品中的MPB64。根据该方法，可应用的样品可为通过使用少量液体培养基仅在结核菌群的细菌细胞实质上开始生长之前的一段时间内培养生物样品获得的培养物。然而，该方法仍需要促进MPB64从生长前的细菌细胞分泌以使大量MPB64在培养基中累积的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利申请特开平11-108931号公报专利文献2：日本专利申请特开2002-62299号公报专利文献3：国际公开WO2009/084481号
技术实现思路
专利技术要解决的问题如上所述，常规方法需要长时间检测结核菌群还需要大量劳力和费用。出于这些原因，结核的确定诊断和早期治疗开始不能进行。因此，已存在对快速检测方法的需求。另外，如果生物样品不含有MPT64或含非常少量的MPT64，也不能进行生物样品的直接检测。结果，结核菌群感染可能被忽略。因此，需要更可靠的检测方法。本专利技术的目的为通过提供简便、快速且更可靠的结核菌群检测方法来解决这些问题。用于解决问题的方案本专利技术人已进行了孜孜不倦的研究来解决上述问题，因此发现该问题可通过加热处理含有结核菌群的生物样品以便细胞外分泌结核菌群特异的分泌蛋白质如MPB64并检测由此分泌的蛋白质来解决，结果，已完成了本专利技术。根据一个方面，本专利技术提供一种结核菌群的检测方法，其包括使结核菌群特异的蛋白质进行免疫学测定，其中所述蛋白质通过使含有结核菌群的生物样品进行加热处理而被细胞外分泌。根据另一方面，本专利技术还提供一种结核菌群检测用试剂盒，作为出于进行上述方法的目的的结核菌群检测用试剂盒，其至少包括使含有结核菌群的生物样品进行加热处理的处理容器，和用于检测通过加热处理分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质的免疫学测定装置。该试剂盒可进一步包括样品处理剂和/或溶剂。本专利技术的检测方法和试剂盒能够快速且简便地检测结核菌群。根据另外的方面，本专利技术还提供用于细胞外分泌结核菌群特异的蛋白质的方法，其包括使含有结核菌群的生物样品进行加热处理。附图说明图1为示出当使用M.bovisBCG东京菌株的细菌细胞时加热处理温度与促进细胞外MPB64分泌的效果之间关系的图。图2为示出当使用M.bovisBCG东京菌株的细菌细胞时加热处理时间与促进细胞外MPB64分泌的效果之间关系的图。具体实施方式用于本专利技术的生物样品不特别限定，只要生物样品可含有结核菌群即可。生物样品的实例包括痰、胸膜积液、支气管分泌物、胃液、血液、脊髓液、尿液和排泄物。优选地，使用痰是因为其细菌浓度高。可选地，呼吸检查期间收集的支气管灌洗液或收集自支气管或肺的组织等可用作生物样品。这些生物样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核菌群的检测方法，其中所述结核菌群产生被细胞外分泌的结核菌群特异的蛋白质，所述方法包括使所述结核菌群特异的蛋白质进行免疫学测定，其中所述蛋白质通过使含有所述结核菌群的生物样品进行40℃至60℃至少15分钟的加热处理而被细胞外分泌。

【技术特征摘要】
2012.04.05 JP 2012-0865661.一种抗体在制备通过下述方法来检测结核菌群的试剂中的用途，其中所述结核菌群产生被细胞外分泌的结核菌群特异的蛋白质，所述方法包括使所述结核菌群特异的蛋白质进行免疫学测定，其中所述蛋白质通过使含有所述结核菌群的生物样品进行40℃至60℃至少15分钟的加热处理而被细胞外分泌，和所述抗体为抗所述结核菌群特异的分泌蛋白质的抗体。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物样品的所述加热处理在40℃至55℃下进行。3.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物样品的所述加热处理进行15分钟以上且2.5小时以下。4.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物样品为选自由痰、支气管分泌物、胸膜积液、胃液、血液、脊髓液、排泄物、支气管灌洗液和收集自支气管或肺的组织组成的组的至少一种样品。5.根据权利要求4所述的用途，其中所述排泄物为尿液。6.根据权利要求4所述的用途，...

【专利技术属性】
技术研发人员：野中浦雄，北川俊之，
申请(专利权)人：株式会社比尔生命，
类型：发明
国别省市：日本;JP