一种牛奶中乳果糖的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种牛奶中乳果糖的检测方法，包括：将牛奶中的乳糖和乳果糖通过β‑D‑半乳糖苷酶反应水解成半乳糖、葡萄糖和果糖，再加入葡萄糖氧化酶将大部分葡萄糖氧化为葡萄糖酸，最后加入过氧化氢酶除去过氧化氢，得到测试液；采用具有安培检测器的离子色谱仪分析测试液，得到乳果糖的含量。本发明专利技术的方法能够准确、灵敏，操作简便地测定牛奶中乳果糖的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种牛奶中乳果糖的检测方法
本专利技术属于乳果糖检测领域，特别涉及一种牛奶中乳果糖的检测方法。
技术介绍
乳果糖是乳糖在牛奶热处理过程中的异构化产物，是评估牛奶杀菌程度和贮藏时间的一项重要指标，国际奶制品组织(IDF)已建议乳果糖的浓度作为区别该奶产品是用巴氏法杀菌，超热处理和已灭菌的指示剂，因此牛奶中乳果糖的准确测定更显得格外重要。传统关于乳果糖的分析方法有色谱和酶分析这两种方法，但是由于牛奶中含有较多的乳糖，会影响乳果糖，使得这两种方法很难进行准确的定量分析。随着近年来离子色谱技术的不断成熟，运用离子色谱测定糖类成为了测定乳果糖的一种新的途径，但是乳糖和乳果糖的分离依然是一道难题，其对淋洗液浓度等条件的要求相当苛刻。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种牛奶中乳果糖的检测方法，该方法能够准确、灵敏，操作简便地测定牛奶中乳果糖的含量。本专利技术的一种牛奶中乳果糖的检测方法，包括：(1)取牛奶样品用水稀释后，依次加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液，静置，过滤，收集滤液；加入β-D-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，混匀后加盖，于50～60℃恒温培养1～2h；然后依次加入葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)、正辛醇、氢氧化钠溶液、过氧化氢和过氧化氢酶，于45～50℃恒温培养3～4h；冷却后定容，过滤，净化，收集滤液作为待测液；(2)采用具有安培检测器的离子色谱仪分析步骤(1)中的待测液，得到乳果糖的含量。所述步骤(1)中的牛奶样品为鲜牛乳或牛奶的添加物(如高钙牛奶、学生营养强化奶等)。所述步骤(1)中的亚铁氰化钾溶液的浓度为200g/L，与牛奶样品的体积比为1:5；硫酸锌溶液的浓度为200g/L，与牛奶样品的体积比为1:5。所述步骤(1)中加入硫酸锌溶液后加入缓冲液[0.34mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)+0.07mol/L磷酸二氢钠(NaH2PO4)，pH＝7.5]调整溶液pH值至7.5；加入β-D-半乳糖苷酶恒温培养后加入缓冲液[0.75mol/L三乙醇胺盐酸盐(C6H15NO3·HCl)+0.01mol/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)，pH＝7.6]调整溶液pH值至7.6。所述步骤(1)中的β-D-半乳糖苷酶与滤液的体积比为0.1:5。所述步骤(1)中的葡萄糖氧化酶、氢氧化钠溶液、过氧化氢、过氧化氢酶与滤液的体积比为0.1:0.5:0.05:0.1:5。所述步骤(1)中的过滤采用0.45μm水相滤膜过滤；净化采用C18小柱净化。所述步骤(2)中的离子色谱仪分析的条件为：检测器：ED40电化学检测器，参比电极为Ag/AgCl、Au电极；色谱柱：CarboPacPA10色谱分离柱；流动相：超纯水；流速：1.0mL/min；淋洗液：10mmol/LKOH；进样体积：25μL。所述色谱柱的规格为：长度250mm×内径4mm。所述步骤(2)中的乳果糖的含量采用外标法定量。本专利技术中采用碳水化合物色谱分析柱CarboPacPA10(4mm*250mm)分离各个不同组分的糖。本专利技术通过具有安培检测器的离子色谱仪分析乳果糖的基本原理是：样品中的乳糖和乳果糖水解成半乳糖、葡萄糖和果糖后，通过碳水化合物色谱柱分离。基于配体交换反应，糖分子上每一个羟基都带有一个非常弱的负电荷，而端基异构碳上所带的羟基可被去质子化，从而带上一个很强的负电荷。糖分子上的这些负电荷与树脂表面上的金属离子的正电荷之间的相互作用使糖被保留，从而达到分离，因此各组份在色谱柱中的保留时间就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，达到了几种糖分的有效分离，通过其在色谱柱上的保留时间定性，峰面积定量。通过测得的果糖含量，扣除样品本底中果糖的含量，可得到乳果糖酶解产生的果糖含量，从而计算得出奶样中乳果糖的含量。本专利技术用亚铁氰化钾和硫酸锌溶液作为沉淀剂，能有效排除蛋白和脂肪对乳果糖分析的干扰。本专利技术采用酶解法将牛奶中大量的乳糖和少部分的乳果糖完全水解，整个前处理过程采用此方法很好的解决了由于牛奶中乳糖含量过高而产生的无法将乳糖和乳果糖完全分离的一个问题。本专利技术中，采用碳水化合物色谱分析柱进行分离，通过具有安培检测器的离子色谱仪分析乳果糖含量。乳果糖和乳糖的水解产物为葡萄糖、半乳糖和果糖，这三种糖在CarboPacPA10碳水化合物色谱分析柱上分离度较好。牛奶空白样品中添加1.0mg/L的乳果糖标准物质，经样品前处理，仪器测定后，被测物的信噪比(S/N)为8.9大于3，表明本专利技术方法的检出限可至1.0mg/L。有益效果(1)本专利技术用β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶对样品进行酶解，既能有效的将样品中乳糖和半乳糖完全提取出来，又能保证它们的酶解产物完全分离互不干扰；(2)本专利技术用具有安培检测器的离子色谱仪进行糖的检测，该方法目前已经较为成熟，糖各个组分的分离度和响应值都比较好；(3)本专利技术为牛奶中乳果糖含量的检测提供了一种高灵敏度的检测手段。附图说明图1为本专利技术中标准物质(乳果糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖)的离子色谱图；图2为实施例1中本底(不加酶)的离子色谱图；图3为实施例1中本底(加酶水解处理后)的离子色谱图；图4为实施例1中样品加标的离子色谱图(加标水平为5.0mg/L)；图5为实施例2中空白样品的离子色谱图；图6为实施例2中样品加标的离子色谱图(加标水平为1.0mg/L)。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1在称量的牛奶空白样品中加入乳果糖标准溶液后摇匀，制得本实施例的乳果糖加标样品。(1)样品前处理移取10.00mL待测牛奶样品于150mL三角瓶中，依次加入2mL浓度为200g/L的亚铁氰化钾溶液、2mL浓度为200g/L的硫酸锌溶液和6.5mL缓冲液[0.34mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)+0.07mol/L磷酸二氢钠(NaH2PO4)，pH＝7.5]，每加试剂均要充分摇匀，全部加完后静置30min，过滤，弃去初滤液，收集滤液。取滤液5mL于10mL容量瓶中，加入100μL的β-D-半乳糖苷酶悬浮液，摇匀、加盖，在50℃下培养1小时。在培养好的试样中依次加入2.0mL缓冲液[0.75mol/L三乙醇胺盐酸盐(C6H15NO3·HCl)+0.01mol/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)，pH＝7.6]、100μL葡萄糖氧化酶悬浮液、1滴正辛醇、0.5mL0.33mol/L氢氧化钠溶液、50μL过氧化氢(30％)和100μL过氧化氢酶悬浮液。每加一种试剂均要摇匀，全部加完后在40℃水浴或烘箱中培养3h。冷却后用蒸馏水定容至10mL，依次通过0.45μm水相滤膜和C18小柱净化后，收集滤液为待测液。(2)具有安培检测器的离子色谱仪测定离子色谱条件为：检测器：ED40电化学检测器，参比电极为Ag/AgCl、Au电极。色谱柱：CarboPacPA10色谱分离柱(4mm*250mm)。流动相：超纯水；流速：1.0mL/min；淋洗液：10mmol/LKOH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛奶中乳果糖的检测方法，包括：(1)取牛奶样品用水稀释后，依次加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液，静置，过滤，收集滤液；加入β‑D‑半乳糖苷酶，混匀后加盖，于50～60℃恒温培养1～2h；然后依次加入葡萄糖氧化酶、正辛醇、氢氧化钠溶液、过氧化氢和过氧化氢酶，于45～50℃恒温培养3～4h；冷却后定容，过滤，净化，收集滤液作为待测液；(2)采用具有安培检测器的离子色谱仪分析步骤(1)中的待测液，得到乳果糖的含量。

【技术特征摘要】
1.一种牛奶中乳果糖的检测方法，包括：(1)取牛奶样品用水稀释后，依次加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液，静置，过滤，收集滤液；加入β-D-半乳糖苷酶，混匀后加盖，于50～60℃恒温培养1～2h；然后依次加入葡萄糖氧化酶、正辛醇、氢氧化钠溶液、过氧化氢和过氧化氢酶，于45～50℃恒温培养3～4h；冷却后定容，过滤，净化，收集滤液作为待测液；其中β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、氢氧化钠溶液、过氧化氢、过氧化氢酶与滤液的体积比为0.1:0.1:0.5:0.05:0.1:5；(2)采用具有安培检测器的离子色谱仪分析步骤(1)中的待测液，得到乳果糖的含量；其中离子色谱仪分析的条件为：检测器：ED40电化学检测器，参比电极为Ag/AgCl、Au电极；色谱柱：CarboPacPA10色谱分离柱；流动相：超纯水；流速：1.0mL/min；淋洗液：10mmol/LKOH；进样体积：25μL。2.根据权利要求1所述的一种牛奶中乳果糖的检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓敏，王建军，孟瑾，郑小平，何亚斌，高勇兴，
申请(专利权)人：上海必诺检测技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31