酸性磷酸酶及其相关生物材料在构建溶磷工程菌中的应用制造技术

本发明专利技术公开了酸性磷酸酶及其相关生物材料在构建溶磷工程菌的应用。该应用为a)或b)或c)或d)的蛋白质在作为磷酸水解酶中的应用：a)由SEQ ID No.2第1‑203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第26‑203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端(C末端)或/和氨基端(N末端)融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。本发明专利技术可用于培育高效活化土壤磷素养分的生物工程菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物领域中酸性磷酸酶及其相关生物材料的用途，特别涉及酸性磷酸酶及其相关生物材料在构建溶磷工程菌的应用。
技术介绍
磷是植物生长发育三大必需元素之一，在生命过程中起重要作用。植物利用的磷素主要来源于土壤。目前，我国有2/3的耕地缺磷，缺磷的主要原因是由于土壤中有效磷含量不足，大约95％的磷为难溶性的无效磷，植物很难吸收利用。我国每年大约消耗1050-1200万吨磷肥(2010年中国化工信息网)，但是磷肥当季植物利用率仅为5％-25％，90％左右的磷肥施入土壤后很快被化学固定。因此，提高磷肥利用效率，活化土壤无效磷素是农业生产迫切解决的科学问题之一。溶磷微生物中酸性磷酸酶、肌醇六磷酸酶在土壤有机磷的分解与释放起着关键作用(Yamamuraetal.,2004；赵小蓉等，2001；陈哲等，2009)。酸性磷酸酶(Acidphosphatase，简称ACPase，E.C.3.1.3.2)，是在酸性条件下催化磷酸单酯水解的酶。此酶除了参与磷酸酯的代谢，还参与代谢调节、能量转换以及信号转导等重要生命活动。酸性磷酸酶具有非常重要的功能，其一，酸性磷酸酶具有磷酸水解酶的活性，通过分解有机质的磷一酯键和磷一酐键释放磷，从而活化土壤中无效磷，在充分利用土壤磷资源、减少磷肥施用上具有重要应用价值；其二，酸性磷酸酶也具有磷酸转移酶活性,在合适的条件下,能将低能磷酸基团转移到核苷的羟基上,在核苷酸生化合成上具有较大的应用价值。核苷酸通常作为食品添加剂和医药中间体，其中，肌苷酸(次黄嘌呤-5′-核苷酸)因为具有更明显的助鲜效果，广泛应用于食品加工领域。目前主要有两种方法生产核苷酸，一种是化学合成法，利用菌体发酵产生肌苷，再用POCl3磷酸化，该方法副产物较多，提纯困难；另一种方法是利用大肠杆菌肌苷激酶磷酸化肌苷，此过程需要ATP的参与，而ATP需要通过产氨杆菌发酵再生，限制了酶法合成的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供一种磷酸水解酶酶活性较高的酸性磷酸酶。为解决以上技术问题，本专利技术提供a)或b)或c)或d)的蛋白质在作为磷酸水解酶中的应用：a)由SEQIDNo.2第1-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQIDNo.2第26-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端(C末端)或/和氨基端(N末端)融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQIDNo.2或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。上述应用中，a)所示的蛋白质为来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的完整酸性磷酸酶，其名称为BmacpA；SEQIDNo.2由203个氨基酸残基组成，第1-25位为信号肽。上述应用中，b)所示的蛋白质为去掉BmacpA的信号肽得到的去信号肽酸性磷酸酶，其名称为NSBmacpA。上述应用中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。c)所示的蛋白质具体可为在NSBmacpA的羧基端或/和氨基端融合组氨酸标签得到的融合蛋白质，如SEQIDNo.6所示的蛋白质，其名称为NSBmacpA-His。SEQIDNo.6由192个氨基酸残基组成。为解决以上技术问题，本专利技术提供核酸分子在制备磷酸水解酶中的应用；所述核酸分子编码上述a)或b)或c)或d)的蛋白质。上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：1)编码序列(CDS)是SEQIDNo.1所示的DNA分子，其名称为BmacpA基因；2)编码序列是SEQIDNo.1的第76至612位所示的DNA分子，其名称为NSBmacpA基因；3)编码序列是SEQIDNo.5所示的DNA分子；其名称为NSBmacpA-His基因；4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述酸性磷酸酶的DNA分子。上述应用中，“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。本专利技术所要解决的另一个技术问题是如何构建具有溶磷活性的微生物。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了上述核酸分子在构建具有溶磷活性微生物中的应用。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种具体的构建具有溶磷活性重组微生物的方法。本专利技术所提供的构建具有溶磷活性重组微生物的方法，包括将上述a)或b)或c)或d)的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到溶磷活性高于所述受体微生物的具有溶磷活性重组微生物。上述方法中，所述溶磷活性体现为磷酸水解酶活性。上述方法中，所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示的DNA分子：1)编码序列是SEQIDNo.1所示的DNA分子；2)编码序列是SEQIDNo.1的第76至612位所示的DNA分子；3)编码序列是SEQIDNo.5所示的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。上述方法中，所述受体微生物可为原核微生物。上述方法中，所述原核微生物具体可为革兰氏阴性细菌。上述方法中，所述革兰氏阴性细菌具体可为埃希氏菌属细菌或柠檬酸杆菌属细菌。上述方法中，所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。所述柠檬酸杆菌属细菌可为柠檬酸杆菌ACCC02187。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了含有所述核酸分子的生物材料。本专利技术所提供的含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为B1)、B2)、B3)或B4):B1)含有所述核酸分子的表达盒；B2)含有所述核酸分子的重组载体；B3)含有所述表达盒的重组载体；B4)上述任一种方法构建的所述具有溶磷活性重组微生物。上述生物材料中，含有所述核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述a)或b)或c)或d)的蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动上述蛋白质基因转录的启动子，还可包括终止上述蛋白质基因转录的终止子。所述重组载体可为pET–NSBmacpA或pHT–BmacpA。本文档来自技高网...

【技术保护点】
a)或b)或c)或d)的蛋白质在作为磷酸水解酶中的应用：a)由SEQ ID No.2第1‑203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第26‑203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.a)或b)或c)或d)的蛋白质在作为磷酸水解酶中的应用：
a)由SEQIDNo.2第1-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由SEQIDNo.2第26-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
d)将SEQIDNo.2或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基
的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。
2.核酸分子在制备磷酸水解酶中的应用；所述核酸分子编码权利要求1中a)或
b)或c)或d)的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或
3)或4)所示的基因：
1)编码序列是SEQIDNo.1所示的DNA分子；
2)编码序列是SEQIDNo.1的第76至612位所示的DNA分子；
3)编码序列是SEQIDNo.5所示的DNA分子；
4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1
所述蛋白质的DNA分子。
4.权利要求2或3中所述核酸分子在构建具有溶磷活性微生物中的应用。
5.构建具有溶磷活性重组微生物的方法，包括将权利要求1中a)或b)或c)
或d)...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙静文，周卫，程明芳，李书田，王玉军，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11