一种快速区分四种血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物、试剂及方法技术

本发明专利技术公开了一种快速区分四种血清型登革病毒的RT‑PCR‑HRM或PCR‑HRM引物、试剂及方法。根据四种血清型的登革病毒基因组序列比对结果，设计了三条引物，以RNA为模板加LC green染料进行一步法RT‑PCR或以构建的含登革病毒280bp碱基的质粒为模板加入LC green染料进行PCR扩增，扩增产物进行HRM分析，HRM标准曲线图与峰型图均可以明显的区分四种血清型的登革病毒。本方法操作简单、试剂成本低廉、检测灵敏度高且分型结果可靠，是一种对四种血清型登革病毒进行检测分型的创新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种快速区分四种血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物、试剂及方法
本专利技术涉及病毒基因分型的方法，具体涉及一种快速区分四种血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物和方法。
技术介绍
登革病毒（denguevirus,DV)为有包膜的单股正链RNA病毒，属黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒，其主要传播媒介为埃及伊蚊和白纹伊蚊，在我国主要为白纹伊蚊。它是引起人类登革热（denguefever,DF）、登革出血热(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克综合征（dengueshocksyndrome,DSS）的主要病原。1779年，在印度尼西亚雅加达，Bylon首先记述了这种被称为关节热的疾病，1869年由英国伦敦皇家内科学院将此病命名为登革热。登革热和登革出血热广泛流行于全球热带和亚热带地区的60多个国家和地区,特别是东南亚、太平洋岛屿及加勒比海地区,在欧洲和北美也发生过由输入性病例引起的小范围感染流行。20世纪,登革热在世界各地发生过多次大流行，病例数达百万，全球大约有25亿人口受到登革病毒感染的威胁，每年约有5000万到一亿人感染登革病毒，50万人需入院治疗，约24000人死亡。在我国流行广泛的地区有广东、广西、海南、辽宁等地,流行季节海南为4～6月，广东和广西为8月。早在1873年，我国厦门曾发生过登革热。1928～1929年，在广州、厦门、杭州、宁波、上海、台湾和香港等地流行。1940年，本病在上海至南通广大地区流行。1942～1945年，本病流行更加严重，不仅流行于沿海地区，甚至蔓延到内地如汉口等地。1978年5月广东佛山市石湾镇首先发生登革热，疫情迅速向四周蔓延。2002年夏天广州出现登革热流行，有1000多人发病。自2014年6月起，广东省发生了大范围的登革热爆发性流行，截止到11月中旬，广东全省登革热发病例已突破4万4千例，报告死亡病例6例。在台湾省高雄市，截止到2014年11月中旬，年度登革热发病例也突破1万例，报告死亡病例15例。2015年截止到11月03日，台湾省共报告登革热病例数29921例，其中台南市达21874例，高雄市7521例，屏东县151例，其余县市均为移入地散发病情，目前累计死亡人数为129人，27例疑似死亡病例待审(台南9例、高雄17例、屏东县1例)，台湾仍有28人于加护病房治疗中。在中国大陆，截止到2015年10月17日，广东潮州市共报告登革热病例1273例。以上资料显示，近年来，登革热在我国亚热带及热带地区几乎每年都有爆发性大范围流行，在当地形成严重的社会公共卫生问题。登革病毒可分为四个抗原性密切相关的血清型,即登革1、2、3、4型。各型登革病毒之间核苷酸序列的同源性为63%-68%,同一血清型各病毒株之间核苷酸序列的同源性大于95%。4个血清型均可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征。DV感染机体后可呈现两种不同的状态,即原发感染状态和继发感染状态。机体初次感染登革病毒后,可表现为隐性感染或一般的发热,症状不明显，同时对同型病毒产生免疫力,而且可能持续终生,但对异型病毒感染的保护作用持续时间较短。在第二次感染异型DV的患者中容易发生DHF和DSS,且病死率较高,其发病机制是依赖抗体增强的感染作用。区分这两种状态对于临床治疗非常重要。由于目前还没有成功的疫苗可以使用,也没有特效的治疗药物，因此登革病毒感染的早期诊断以及分型,对于病例的临床治疗以及疾病监测,流行病学调查和疾病控制措施的开展有非常重要的意义。在登革病毒感染实验室诊断方法上,血清学试验和分子生物学的研究已经取得一定的进展。登革病毒的鉴定及分型,传统的方法主要有病毒分离与鉴定、血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验等。敏感细胞培养或动物分离病毒仍然是诊断的“金标准”，但这种方法很费时，且很多实验室缺少开展病毒分离所必备的条件。另一方面，病毒特异性抗体在发病3～5天后才能检测到,血清学早期检测灵敏度不高，且特异性差、操作繁琐、耗时,尤其是难以准确分型。随着各型登革病毒单克隆抗体的研制成功,基于登革病毒型特异性单克隆抗体的分型鉴定方法,如间接免疫荧光技术(IFA)、酶联免疫吸附技术(ELISA)广泛应用于全球各个登革病毒检测实验室,登革病毒的准确分型问题得到解决,但仍存在与其它黄病毒交叉反应问题,且耗时、成本高、操作复杂。1990年,Deubel等首次报道了应用PCR技术检测登革病毒核酸。1992年，Lanciotti等设计一套巢式PCR引物，利用各型登革病毒PCR扩增产物大小的不同来分型。此后的十多年时间内,中外文献上出现了很多关于应用PCR技术检测登革病毒的报道,从多管两步法到单管一步法，从四对型特异性引物分别反应到单管多重反应，但仍存在需要多对引物、电泳检测环节易污染而导致假阳性等问题。荧光PCR虽然不易污染，但需要多对引物探针，价格昂贵，从而不能广泛应用。上述方法均未能克服操作复杂、费时、费用高、可靠性差等缺点，在临床实践中的应用受限。因此，目前急需一种操作相对简易、检测结果可靠且检测成本低廉的登革病毒血清型分型方法。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术建立了一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物和方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠且检测成本低廉，有利于在临床实践中推广应用。本专利技术的目的在于提供三组快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物。本专利技术的另一目的在于提供一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM方法。本专利技术的再一目的在于提供一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM试剂。本专利技术所采取的技术方案是：碱基位点在快速区分不同血清型登革病毒中的应用，所述碱基位点为：Genbank编号为EU848545.1的DV1标准株基因组中第10648位碱基G，第10671位碱基T，第10672位碱基A，第10675位碱基G；Genbank编号为AF038403.1的DV2标准株基因组中第10638位碱基A，第10661位碱基C，第10662位碱基T，第10665位碱基G；Genbank编号为M93130.1的DV3标准株基因组中第10610位碱基G，第10633位碱基C，第10634位碱基T，第10637位碱基G；Genbank编号为AY947539.1的DV4标准株基因组中第10570位碱基A，第10593位碱基T，第10594位碱基G，第10597位碱基A。基因片段在快速区分不同血清型登革病毒中的应用，所述基因片段为：67bp的基因片段：5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAG-3’（SEQIDNO：171）；5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCACAG-3’（SEQIDNO：172）；5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCACAG-3’本文档来自技高网...

【技术保护点】
碱基位点在快速区分不同血清型登革病毒中的应用，所述碱基位点为：Genbank编号为EU848545.1的DV1标准株基因组中第10648位碱基G，第10671位碱基T，第10672位碱基A，第10675位碱基G；Genbank编号为AF038403.1 的DV2标准株基因组中第10638位碱基A，第10661位碱基C，第10662位碱基T，第10665位碱基G；Genbank编号为M93130.1的DV3标准株基因组中第10610位碱基G，第10633位碱基C，第10634位碱基T，第10637位碱基G；Genbank编号为AY947539.1的DV4标准株基因组中第10570位碱基A，第10593位碱基T，第10594位碱基G，第10597位碱基A。

【技术特征摘要】
1.碱基位点在快速区分不同血清型登革病毒中的应用，所述碱基位点为：Genbank编号为EU848545.1的DV1标准株基因组中第10648位碱基G，第10671位碱基T，第10672位碱基A，第10675位碱基G；Genbank编号为AF038403.1的DV2标准株基因组中第10638位碱基A，第10661位碱基C，第10662位碱基T，第10665位碱基G；Genbank编号为M93130.1的DV3标准株基因组中第10610位碱基G，第10633位碱基C，第10634位碱基T，第10637位碱基G；Genbank编号为AY947539.1的DV4标准株基因组中第10570位碱基A，第10593位碱基T，第10594位碱基G，第10597位碱基A；所述应用不用于疾病的诊断和治疗。2.基因片段在快速区分不同血清型登革病毒中的应用，所述基因片段为：67bp的基因片段：5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAG-3’（SEQIDNO：171）；5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCACAG-3’（SEQIDNO：172）；5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCACAG-3’（SEQIDNO：173）；5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAACATCAATCCAGGCACAG-3’（SEQIDNO：174）；5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTGCAACATCAATCCAGGCACAG-3’（SEQIDNO：175）；45bp的基因片段：5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQIDNO：176）；5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQIDNO：177）；5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQIDNO：178）；5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQIDNO：179）；5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQIDNO：180）；所述应用不用于疾病的诊断和治疗。3.一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物，所述引物扩增出来的目的基因片段中含有以下碱基位点：Genbank编号为EU848545.1的DV1标准株基因组中第10648位碱基G，第10671位碱基T，第10672位碱基A，第10675位碱基G；Genbank编号为AF038403.1的DV2标准株基因组中第10638位碱基A，第10661位碱基C，第10662位碱基T，第10665位碱基G；Genbank编号为M93130.1的DV3标准株基因组中第10610位碱基G，第10633位碱基C，第10634位碱基T，第10637位碱基G；Genbank编号为AY947539.1的DV4标准株基因组中第10570位碱基A，第10593位碱基T，第10594位碱基G，第10597位碱基A；所述引物包...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜丙峰，郭鹏举，黄韧，张复春，赵令斋，
申请(专利权)人：广东省实验动物监测所，广州市第八人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44