一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程转化技术领域，公开了一种针刺‑真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法，通过蓖麻种子预培养、针刺预培养蓖麻种子的上胚轴、真空渗透将含目的基因的农杆菌菌液侵染蓖麻种子，然后共培养、菌除移栽即可；所述真空渗透是将针刺好的种子在菌液中，抽真空负压‑30～‑70 kPa下处理5～20min，放空气2～5min，再次负压‑30～‑70 kPa下处理2～5min，本发明专利技术直接以预培养的种子为受体，不需要离体组织培养，该方法从蓖麻种子预培养至提取DNA检测需要15天可获得转基因植株，转化周期短，转化率高，操作较简单，重复性好。

【技术实现步骤摘要】
一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法
本专利技术涉及植物基因工程转化
，更具体地，涉及一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法。
技术介绍
蓖麻是世界十大油料作物之一，是特种工业油源作物和新型石油作物。蓖麻油有独特的品质和作为“绿色石油”的可再生性能，国内外对蓖麻的研究已日益重视，并有了很大的进展。现在限制蓖麻大面积推广发展的主要问题是病害、虫害和蓖麻毒素等，所以培育抗病虫害、低毒蛋白的品种是蓖麻育种关键，但用常规方法获得这些新种质资源很难。随着2010年蓖麻的全基因组测序工作已经完成，以及分子生物学和分子遗传学的迅速发展。如果能将基因工程育种结合到蓖麻育种来，有目的的将外源基因或内源DNA导入蓖麻基因组，通过外源基因的直接表达，或通过内源基因表达的调控，从而选育出抗病、抗虫、抗逆、高产优质的蓖麻品种，为快速培育出蓖麻新种质资源提供强有力保证。但蓖麻基因工程工作已经开展多年，有关蓖麻转基因方面报道很少。MckeonTA等（2003年）申请美国专利，用农杆菌介导方法把目的基因从蓖麻花蕾受伤处转入，所结的种子经GUS基因检测证明目的基因已转入到蓖麻中。这种方法不用复杂仪器，操作简单，避免繁琐的组织培养过程，但其缺点是获得阳性株大多数为嵌合体。Sujatha等（2005）首次以蓖麻种子的胚轴作为外植体，用农杆菌介导法将hpt和gus基因导入蓖麻受体内，经潮霉素筛选后共获得0.08%转化率植株。Malathi等（2006）在Sujatha建立的遗传转化体系基础上，体系稍作变动，以蓖麻子叶节作为外植体，同样采用农杆菌介导法将目的基因cryIAb导入蓖麻受体内，经潮霉素筛选后共获得0.42%转化率植株。Sujatha等（2009）以蓖麻胚轴作为外植体，用农杆菌介导法和基因枪法将cry1EC基因导入蓖麻受体内，经潮霉素和卡那霉素筛选后分别获得0.82%和0.69%转化率植株，获得了抗斜纹夜蛾和尺蠖的植株。Ganesh（2012）以蓖麻子叶节作为外植体，采用农杆菌介导法将GUS基因和可可的几丁质酶基因分别导入蓖麻受体内，经卡那霉素筛选后分别获得1.17%和1.06%转化率植株，阳性株具有抗枯萎病特性。刘鹏（2012）以蓖麻子叶节为外植体，采用农杆菌介导法将蓖麻P450基因干涉载体导入蓖麻受体内，经卡那霉素筛选后获得0.1%转化率植株。黄凤兰等（2011年）申请专利，以蓖麻子叶节作为受体，用农杆菌介导法获得阳性株。但上面这些技术的缺点是所需要的时间较长，离体组织培养再生难，转化效率低，重复性差，蓖麻再生体系不能与现有的植物转化方法更好结合。所以蓖麻转基因的研究还缺乏深入，满足不了开展蓖麻分子水平的研究，急需建立一种比较成熟的蓖麻遗传转化体系。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法，通过蓖麻种子预培养、针刺预培养蓖麻种子的上胚轴、真空渗透将含目的基因的农杆菌菌液侵染蓖麻种子，然后共培养、菌除移栽即可；所述真空渗透是将针刺好的种子在菌液中，抽真空负压-30～-70kPa下处理5～20min，放空气2～5min，再次负压-30～-70kPa下处理2～5min。现有技术中对于蓖麻种子的遗传转化，多是采用离体组织培养，其培养时间长，且成功率低，本专利技术直接以蓖麻种子作为受体，蓖麻种子前期不需要进行特别的消毒，直接通过针刺、间歇式的真空渗透即可获得高转化率的蓖麻种子。优选地，所述预培养是将蓖麻种子放在40℃温水浸泡30min，然后放到用培养皿装有吸好水的滤纸上面培养12～24h。优选地，所述针刺预培养蓖麻种子的上胚轴是指用沾有含目的基因的农杆菌菌液的细针针刺经预培养的种子的上胚轴；更优选地，所述针刺是在超净工作台中，一手用1mL（针头ø0.45）规格的一次性注射器蘸取含目的基因农杆菌菌液，一手用镊子固定住预培养的种子，将针头刺向种子的胚部位，针刺位置要准（上胚轴），每次刺前先蘸取菌液，针刺深度约1mm。具体地，本专利技术所说的真空渗透是把针刺好的种子，放到盛悬浮好的含目的基因的农杆菌菌液的650mL透气的组培瓶中，将透气的组培瓶放在真空压缩机中，抽真空负压-30～-70kPa下处理5～20min，放空气2～5min，再次负压-30～-70kPa下处理2～5min。抽真空结束后，继续在摇床上28℃，100rpm摇30min。优选地，所述共培养是取出侵染后的种子，用无菌滤纸吸干蓖麻种子表面的菌液，转入1/2MS培养基28℃黑暗条件下共培养3～4d。优选地，所述菌除是从培养基取出共培养的种子，转入无菌水中清洗5min，再转入含1000mg/L头孢霉素的无菌水中浸泡1h，再用无菌水清洗3～4次，尽可能去除种子表面的农杆菌。优选地，所述移栽是暗培养后，去除发芽的种子表面的农杆菌，直接放在育苗土中育苗；具体地，所述移栽是将菌除种子播种到装有进口芬兰诺万播基质NOVARBO培养土32孔育苗盘（规格：上口5.8cm×高5.0cm×底部3.0cm）。当种子从培养土长出至3～5叶期，剪取新叶用简易CTAB方法提取DNA检测。优选地，所述含目的基因的农杆菌菌液的OD600为0.6～1.1。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法，通过蓖麻种子预培养、针刺预培养蓖麻种子的上胚轴、真空渗透将含目的基因的农杆菌菌液侵染蓖麻种子，然后共培养、菌除移栽即可；所述真空渗透是将针刺好的种子在菌液中，抽真空负压-30～-70kPa下处理5～20min，放空气2～5min，再次负压-30～-70kPa下处理2～5min，本专利技术直接以预培养的种子为受体，不需要离体组织培养，该方法从蓖麻种子预培养至提取DNA检测需要15天可获得转基因植株，转化周期短，转化率高，操作较简单，重复性好。附图说明图1是pCAMBIA1305.1空载体图谱。图2是pYLRNAi-PAL超表达（A）和反义表达载体（B）图谱。图3是pYLRNAi-PEPC1反义表达载体图谱。图4是蓖麻遗传转化过程示意图。图5是不同浓度潮霉素筛选转化株。图6是萌发种子组织化学GUS染色，其中，1～5：pCAMBIA1305.1空载体转化蓖麻种子3天胚轴染色，6：pCAMBIA1305.1空载体转化蓖麻种子7天胚轴、子叶染色；CK：没有处理的蓖麻种子胚轴染色。图7是pCAMBIA1305.1空载体转化后潮霉素标记PCR鉴定，其中，泳道M：MarkerDL2000；泳道1：阳性对照，以载体为模板进行PCR扩增；泳道2：阴性对照，以未转化蓖麻植株DNA进行PCR扩增；泳道3～9：蓖麻转基因株的PCR鉴定，其中泳道3、4、5、6、8、9是阳性转化株，泳道7是未转化株。图8是pCAMBIA1305.1空载体转化后根茎叶潮霉素标记RT-PCR鉴定，其中，泳道M：MarkerDL2000；泳道1：阳性对照，以pCAMBIA1305.1载体为模板进行PCR扩增；泳道2：阴性对照，以未转化蓖麻植株DNA进行PCR扩增；泳道3～5：蓖麻转基因株根的PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针刺‑真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法，其特征在于，通过蓖麻种子预培养、针刺预培养蓖麻种子的上胚轴、真空渗透，将含目的基因的农杆菌菌液侵染蓖麻种子，然后共培养、菌除移栽即可；所述真空渗透是将针刺好的蓖麻种子在菌液中，抽真空负压‑30～‑70 kPa下处理5～20min，放空气2～5min，再次负压‑30～‑70 kPa下处理2～5min。

【技术特征摘要】
1.一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法，其特征在于，通过蓖麻种子预培养、针刺预培养蓖麻种子的上胚轴、真空渗透，将含目的基因的农杆菌菌液侵染蓖麻种子，然后共培养、菌除移栽即可；所述预培养是将蓖麻种子放在40℃温水浸泡30min，然后放到用培养皿装有吸好水的滤纸上面培养12～24h；所述针刺预培养蓖麻种子的上胚轴是指用1mL、针头ø0.45规格的一次性注射器蘸取含目的基因农杆菌菌液，将针头刺向种子的上胚轴，每次刺前先蘸取菌液，针刺深度约1mm；所述真空渗透是将针刺好的蓖麻种子在菌液中，抽真空负压-30～-70kPa下...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆建农，殷学贵，施玉珍，刘颖，李卫锦，陈旺东，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东;44