本发明专利技术公开了一种检测微量γ‑球蛋白的荧光试剂、制备方法及应用，属于荧光生物传感器领域。该荧光试剂由TABD‑Py‑PF6和良溶剂组成。将(1Z,3Z)‑1,4‑二(4‑甲氧羰基)苯基‑1,4‑二溴‑1,3‑丁二烯溶解于良溶剂中，加入4‑吡啶苯硼酸、催化剂和碱性盐，反应得到TABD‑Py；将TABD‑Py溶于溶剂中，先加入碘甲烷合成碘盐，再加入六氟磷酸钾，反应得到TABD‑Py‑PF6。将TABD‑Py‑PF6溶解于良溶剂中得到荧光试剂；该荧光试剂不需要金属离子的参与，对γ‑球蛋白具有特异性的“点亮”型荧光响应，对γ‑球蛋白的检测灵敏度高且非常快捷，具有高度选择性；它具有良好可视化的检出信号，根据实际需要可以完全脱离高精仪器，在很大程度上满足当今对于血清中γ‑球蛋白的检测要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂、制备方法及应用，具体涉及一种用于溶液荧光检测血清中微量γ-球蛋白的实时“点亮”型荧光试剂及制备方法，属于荧光生物传感器领域。
技术介绍
球蛋白是一种常见的蛋白，基本存在于所有的动物体中，其球蛋白的正常值是20-35g/L,其中γ-球蛋白的正常值为8.3-23g/L。球蛋白具有免疫作用，因此也有人称球蛋白为免疫球蛋白。蛋白的动态变化可以反映肝脏功能状态，血清蛋白经电泳后分为白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ-球蛋白五条区带，γ-球蛋白主要由免疫球蛋白组成，除免疫球蛋白外，绝大部分的血清蛋白质由肝脏合成。伴有肝功能损害的疾病(乙型肝炎及其后果如肝硬化、失代偿肝病和肝细胞癌)往往引起血清白蛋白浓度及构成比降低，而由肝外合成的球蛋白尤其是γ-球蛋白浓度及构成比增高，α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白浓度及构成比走向不稳定。γ-球蛋白作为反映免疫功能的指标之一，当其增多时往往预示着肝病的发生。例如慢性肝炎，肝硬化，甚至走向肝纤维化的局面。综上，对血清中γ-球蛋白含量的特异性定量检测具有重要的临床应用。以往对于γ-球蛋白的检测主要有以下几个方法：免疫扩散法、电泳法、盐析法和免疫比浊法。电泳法利用带电粒子的定向迁移现象来检测，但操作相对繁琐，整个过程易受到电场强度、电渗现象等诸多因素影响；免疫扩散法分为单扩散法和双扩散法，利用在抗原、抗体孔之间形成的沉淀线进行估算，并与相应的标准品浓度对照，这种方法敏感度不高，只有当比例适量时才会出现白色沉淀，检测时间长，而且只能进行粗略定量；盐析法利用蛋白质在不同盐溶液中溶解度不同而产生沉淀的原理，后续还需要层析除盐，操作步骤多；免疫比浊法利用抗原与抗体间结合形成复合物，在光的照射下形成的透射光或散射光作为计算单位。这种方法简便、可自动化，但是要求结合后形成的复合物数量足够多、颗粒足够大，否则对光通路影响不大，而且成本较高，检测时间长。近年来，酶联免疫吸附法常用于临床中，其方法简便，商品化试剂盒，重复性好、变异系数小，但其易受多方面因素的干扰；一种形式的干扰来自代谢物，如果它们可能再免疫测定中具有交叉反应性；另一种干扰来自抗体的形成。目前，化学方法检测γ-球蛋白往往采用金属与球蛋白的配位作用使荧光猝灭的原理，例如利用纳米金检测γ-球蛋白时，发生猝灭的原因是γ-球蛋白与纳米金形成化学键改变了色氨酸周围的极性环境，改变了氨基酸的二级结构；这种方法简单易实现，但是采用贵金属，而且对血清白蛋白等均有猝灭作用，不具备特异性。2001年，唐本忠课题组报道了“聚集诱导发光(AIE)”现象，由于其独特的“点亮”效果，AIE分子被应用于检测一些生物分子，如DNA，RNA与蛋白质等，目前未见到“点亮”型的AIE分子应用于γ-球蛋白的检测。(Bechmann,L.P.；Jochum,C.；Kocabayoglu,P.JournalofHepatology,2010,53,4,639-647；Ogunkeye,A.L.；Roluga,S.Pathophysiology,2006,42,13,91-93；Ju,H.Y.；Jang,J.Y.；Jeong,S.；Won,T.C.ClinicalandMolecularHepatology,2012,18,213-218；Xu,X.；Liu,C.L.FrontMed,2012,6,421-427；Du,Z.Q.；Li,B.；Wei,Y.Q.Hepatobiliary&PancreaticDiseasesInternational,2011,10,265-269；Azizi,G.；Abolhassani,H.；Asgardoon,M.H.；Shaghaghi,S.；Negahdari,B.；Mohammadi,J.；Rezaei,N.；Aghamohammadi,A.ExpertReviewofClinicalPharmacology,2015,9,91-102；Ankita,S.；Kalyan,S.G.；Bhanu,P.S.；Arvind,K.G.MethodsAndApplicationsinFluorescence,2015,3,025002；Sekar,G.；Kandiyil,S.T.；Sivakumar,A.；Mukherjee,A.；Chandrasekaran,N.JournalofPhotochemistryandPhotobiology.B,2015,153,222-232；JoshiP,C.S.；Dey,S.；Shanker,V.；Ansari,Z.A.；Singh,S.P.；Chakrabarti,P.JournalofColloidInterfaceScience,2011,355,402–410；Naveenraj,S.；Anandan,S.；Kathiravan,A.；Renganathan,R.；Ashokkumar,M.JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2010,53,804-813；Hong,Y.N.；Lam,J.W.Y.；Tang,B.Z.ChemicalSocietyReview,2011,40,5361–5388；Huang,J.；Li,Z.ChemicalCommunications,2011,47,12385–12387；Mei,J.；Leung,N.L.；Kwok,R.T.K.；Lam,J.W.Y.；Tang,B.Z.ChemicalReview,2015,115,11718-11940).
技术实现思路
针对现有化学试剂对γ-球蛋白的检测往往需要金属离子参与，而且特异性不高，在定量检测γ-球蛋白时需要进行预先分离等问题，本专利技术的目的之一在于提供一种简单易行检测微量γ-球蛋白的荧光试剂，所述荧光试剂不需要金属离子的参与，对γ-球蛋白具有特异性的“点亮”型荧光响应，对γ-球蛋白的检测灵敏度高且非常快捷，并具有高度选择性；目的之二在于提供一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂的制备方法，所述制备方法简单，操作方便。本专利技术的目的由以下技术方案实现：一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂，所述荧光试剂由TABD-Py-PF6和良溶剂1组成；其中，所述TABD-Py-PF6为4-((1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯-4-(吡啶-4-)基-1,3-丁二烯基)-1-甲基吡啶六氟磷酸盐的简称，其结构式如下：所述良溶剂1为去离子水、磷酸盐缓冲液和无血清培养液中的一种；所述TA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测微量γ‑球蛋白的荧光试剂，其特征在于：所述荧光试剂由TABD‑Py‑PF6和良溶剂1组成；其中，所述TABD‑Py‑PF6的结构式如下：
【技术特征摘要】
1.一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂，其特征在于：所述荧光试剂由
TABD-Py-PF6和良溶剂1组成；其中，所述TABD-Py-PF6的结构式如下：
2.根据权利要求1所述的一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂，其特征在于：
所述良溶剂1为去离子水、磷酸盐缓冲液和无血清培养液中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂，其特征在于：
所述TABD-Py-PF6的浓度为10-3～10-5mol/L。
4.一种如权利要求1、2或3所述的检测微量γ-球蛋白的荧光试剂的制备方
法，其特征在于：所述方法步骤如下：
(1)将(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基-1,4-二溴-1,3-丁二烯、4-吡啶苯硼
酸、四(三苯基膦)钯和碱性盐溶解于甲苯和甲醇的混合溶剂中，在无水无氧条件
下，于70～80℃搅拌反应18～30h，提纯，得到(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基
-1,4-二(4-吡啶)基-1,3-丁二烯，简称TABD-Py；
(2)将TABD-Py溶解于溶剂中，得到TABD-Py溶液；向TABD-Py溶液
中加入碘甲烷，于30～40℃下反应8～16h，加入沉淀剂，过滤，得到固体a；
(3)将固体a溶解于丙酮中，加入饱和六氟磷酸钾水溶液，在搅拌下，于
【专利技术属性】
技术研发人员：董宇平，刘派，王远航，陈笛笛，董晓燚，李汉军，佟斌，石建兵，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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