一套用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测的多核苷酸、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测的多核苷酸、方法和试剂盒。具体地本发明专利技术中公开了可用作MRSA实时荧光PCR检测标准分子的多核苷酸和DNA构建物pXL09。本发明专利技术的质粒标准分子解决了MRSA实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证MRSA实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为MRSA实时荧光PCR方法检测提供了可靠质量控制方法。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术涉及一套生物工程
的质粒分子，具体涉及一套用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测的多核苷酸、方法和试剂盒。

技术介绍

金黄色葡萄球菌是医院获得性感染最常见的致病菌之一，随着抗菌药物的广泛应用，尤其是随着广谱抗生素的广泛使用，金黄色葡萄球菌耐药菌株不断出现，且呈多重耐药性。自1961年第一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)被发现以来，MRSA的感染率和分离率不断增加，在全世界范围内广泛传播，常造成医院感染的暴发流行。MRSA的主要耐药机制为细菌获得一种能够编码青霉素结合蛋白(PBP2a)的mecA基因，使其对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类等抗生素的耐药率均较高，呈多重耐药性。近年来，世界各地分离的MRSA占金黄色葡萄球菌的比率呈逐年上升趋势。法国、日本等国MRSA的检出率均在30％以上，MRSA感染已与乙型肝炎、获得性免疫缺陷综合征并列世界范围内三大最难解决的感染性疾患。
聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)具有快速、简易、稳定的特点，对快速鉴定MRSA具有重要意义，常用的包括普通PCR检测及实时荧光PCR检测方法。常规PCR检测方法具有较高的敏感性和良好的特异性，可以满足临床对普通标本的检测；实时荧光PCR方法检测细菌数的下限很低，灵敏度远高于普通PCR。此外，临床实时荧光PCR可根据Ct值和模板拷贝数之间的线性关系计算样品模板的DNA表达水平。因此，实时荧光PCR可以对样品中的目的基因进行精确定量，更适用于MRSA感染和环境监控的早期判断。
质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。但是由于受到DNA定量检测量值溯源水平的限制，目前可查的质粒DNA标准物质还比较少，针对MRSA检测的质粒DNA标准物质还是空白。在生物计量科学领域，质粒DNA标准物质研究受到广泛重视，参与该领域研究的国际国内单位包括美国的国家标准技术研究院(NIST)，英国政府检测标准集团(LGC)，欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院(IRMM)以及中国计量科学技术研究院等，至今已经有5个质粒有证标准物质研发成功。由于针对MRSA的PCR相关检测方法的质粒DNA标准物质的研制还是空白，在实际MRSAPCR检测时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性、有效性和可靠性。

技术实现思路

本专利技术的目的在于提供一套适用于MRSA实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其应用。
本专利技术的第一方面，提供了一套分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含MRSA的mecA基因序列。
在另一优选例中，所述MRSA的mecA基因序列选自下组：
(a)序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸序列；
(b)核苷酸序列与SEQIDNO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；
(c)序列与SEQIDNO.:1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQIDNO.:1所示序列长度的20％-100％(较佳地50％-100％，更佳地80％-100％，最佳地90％-100％，如95％)的多核苷酸序列；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示。
本专利技术的第二方面，提供了一套分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本专利技术第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。
在另一优选例中，所述DNA构建物中包含MRSA的mecA基因序列。
在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。
在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。
在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为MRSA检测的标准分子(质粒标准分子)。
在另一优选例中，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。
本专利技术的第三方面，提供了一套试剂盒，所述试剂盒中包括本专利技术第一方面所述的多核苷酸或者本专利技术第二方面所述的DNA构建物。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对特异性扩增MRSA的mecA基因序列。
在另一优选例中，特异性扩增MRSA的mecA基因序列的所述的引物对选自下组：
SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的引物对；
SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6所示的引物对；
SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8所示的引物对；
SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:10所示的引物对；
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对特异性扩增MRSA的mecA基因序列。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序列如SEQIDNO.:11所示。
本专利技术的第四方面，提供了如本专利技术第一方面所述的多核苷酸、本专利技术第二方面所述的DNA构建物、或本专利技术第三方面所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于MRSA的检测。
在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。
在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。
本专利技术的第五方面，提供了一套MRSA实时荧光定量PCR检测方法，所采用的标准物质是如本专利技术第一方面所述的多核苷酸或本专利技术第二方面所述的DNA构建物。
本专利技术的第六方面，提供了一套多核苷酸产品，所述产品包括：
(i)MRSA标准品，所述的标准品选自：本专利技术第一方面所述的多核苷酸或者本专利技术第二方面所述的DNA构建物；
(ii)特异性扩增MRSA的mecA基因序列的引物对，所述引物对为：
SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的序列构成的引物对。
在另一优选例中，所述的产品为多核苷酸的组合(combination)，较佳地所述组分(i)和(ii)是各自独立的。
在另一优选例中，所述的产品为试剂盒形式。
本专利技术的第七方面，提供了一套MRSA检测的质粒标准分子的制备方法，包括以下步骤：
①人工合成MRSA的mecA基因序列，所述MRSA的mecA基因如SEQIDNO.:1所示；
②将步骤①所得基因序列克隆至克隆载体上，得到MRSA检测的质粒标准分子。
在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK或pGEM。
在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19。
应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是本专利技术质粒标准分子pXL09的图谱。
图2是本专利技术所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特在于，所述试剂盒中包括：标准分子，所述标准分子中含有SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；优选地，所述试剂盒中还包括引物序列，所述引物序列用于特异性扩增SEQ ID NO.:1所示的序列，所述引物序列选自下组：(1)SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的引物序列；(2)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物序列；(3)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物序列；和(4)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物序列。

【技术特征摘要】
1.一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特在于，所述试剂
盒中包括：
标准分子，所述标准分子中含有SEQIDNO.:1所示的多核苷酸；
优选地，所述试剂盒中还包括引物序列，所述引物序列用于特异性扩增SEQ
IDNO.:1所示的序列，所述引物序列选自下组：
(1)SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的引物序列；
(2)SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6所示的引物序列；
(3)SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8所示的引物序列；和
(4)SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:10所示的引物序列。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列选自下组：
(a)序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸序列；
(b)核苷酸序列与SEQIDNO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)
的多核苷酸序列；
(c)序列与SEQIDNO.:1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为
为SEQIDNO.:1所示序列长度的20％-100％(较佳地50％-100％，更佳地80％
-100％，最佳地90％-100％，如95％)的多核苷酸序列；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
3.一种分离的DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物中包含权利要
求2所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体
序列。
4.如权利要求3所述的DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物为线性
DNA构建物或环状DNA构建物；优选地所述DNA构建物为质粒或表达载体；更
优选地，所述质粒或表达载体的序列如SEQIDNO:2所示。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包...

【专利技术属性】
技术研发人员：许丽，刘刚，梁文，李妍，闻艳丽，李兰英，徐勤，
申请(专利权)人：上海市计量测试技术研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31