抗TNFα类单克隆抗体的阳离子交换色谱纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种抗TNFα类单克隆抗体的阳离子交换色谱纯化方法。通过在CEX多步洗脱过程中添加尿素和甜菜碱类表面活性剂将包含抗体和污染物的混合物中的污染物去除，使多聚体与抗体分离。本发明专利技术所提供的方法污染物分离效果好；层析过程样品调节简单，避免了pH值的剧烈变化，最终纯化产物中多聚体含量显著降低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单克隆抗体制备，具体涉及抗TNFα类单克隆抗体的阳离子交换色谱纯化方法。
技术介绍
抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)单克隆抗体(McAb)在临床治疗败血症休克、类风湿性关节炎等疾病中有广泛的应用前景,如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、Golimumab都是TNFα类抗体。其中阿达木单抗是全球首个被批准的抗肿瘤坏死因子α(TNFα)全人源单克隆抗体。阿达木单抗可阻止TNFα与其细胞表面受体结合，从而阻断TNFα的生物学活性，最终减轻炎症反应并减少破骨细胞激活，达到控制并缓解症状体征的目的。传统纯化方法如中国专利CN102257006A，公开了通过亲和层析捕获步骤分离和纯化抗体的方法，ProteinA柱由于选择性高和去污染物能力强，经常被首选进行抗体捕获，但其价格昂贵、洗脱的低pH易导致高分子聚合物形成、ProteinA配基掉落等缺点，使越来越多的研究开始关注用非ProteinA工艺来解决现有问题。中国专利CN103998469A公开了用阳离子交换柱、疏水相互作用柱和阴离子交换柱来替代ProteinA柱去除抗体污染物。其中，具有改进载量的阳离子填料可用来处理发酵后处理的料液，但料液在加载到特定柱上后，由于污染物含量较高，吸附到色谱柱产生竞争会影响层析中多聚体去除，给后续纯化中多聚体的去除带来不便。中国专利CN102119168A公开了一种使用非离子聚合物的层析步骤去除蛋白质聚集物，随后使用强化溶解的添加剂进行离子交换层析，但使用的添加剂浓度偏高，用在抗体纯化过程中，有导致抗体变性失活的风险。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有技术的缺陷，提出一种能够有效去除多聚体等污染物和稳定样品的阿达木抗体及抗TNFα类单克隆抗体的纯化方法。申请人在研究中发现在蛋白复性过程中添加的辅助因子(如尿素和表面活性剂等低浓度变性剂)能够通过提高折叠中间体或伸展肽链的延展度来抑制聚集体生成。而这些辅助因子除了能更好地去除多聚体，本身还有稳定抗体高级结构的作用，抑制多聚体的形成。因此，在色谱操作中引入多步冲洗和洗脱，并在洗脱缓冲液中加入适当的添加剂，能够有助于去除多聚体等污染物和稳定样品。根据上述发现，申请人提出了如下技术方案：本专利技术的技术方案一方面提供了一种纯化抗TNFα类单克隆抗体的方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其特征在于，上样平衡后，进行两次洗脱，其中第一次洗脱的洗脱液中含有0.1-0.5mol/L尿素，第二次洗脱的洗脱液中含有质量分数0.1％-1.0％的甜菜碱类表面活性剂。在一些实施方式中，所述的甜菜碱类表面活性剂选自十二烷基二羟乙基甜菜碱、十八烷基二羟乙基甜菜碱或椰油酰胺丙基甜菜碱。在一些实施方式中，所述的第一次洗脱的洗脱液为pH6.0的含0.2mol/L尿素的20mmol/LPBS缓冲液。在一些实施方式中，所述的第二次洗脱的洗脱液为pH5.5-6.5、含有质量分数0.1％-1.0％的甜菜碱类表面活性剂和150-200mmol/L氯化钠的20-60mmol/L柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方式中，所述的柠檬酸盐缓冲液选自柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、醋酸钠-醋酸缓冲液，或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。根据上述技术方案提供的方法，具体包括以下步骤：1)将CHO细胞发酵表达后菌液分离；2)将发酵液用水稀释，调节pH至6.00±0.10；3)过阳离子交换柱，用含有0.1-0.5mol/L尿素的缓冲液进行第一次洗脱；用含有质量分数0.1％-1.0％的甜菜碱类表面活性剂的缓冲液进行第二次洗脱，收集洗脱组分。本专利技术的技术方案还具体的提供了一种纯化阿达木单抗的方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其特征在于，上样平衡后，进行两次洗脱，其中第一次洗脱的洗脱液中含有0.1-0.5mol/L尿素，第二次洗脱的洗脱液中含有质量分数0.1％-1.0％的甜菜碱类表面活性剂。根据上述技术方案提供的方法，在一些实施方式中，所述的甜菜碱类表面活性剂选自十二烷基二羟乙基甜菜碱、十八烷基二羟乙基甜菜碱或椰油酰胺丙基甜菜碱。本专利技术的具体实施方式包括如下步骤：1)将CHO细胞发酵表达后菌液分离；2)将发酵液用水稀释，调节pH至6.00±0.10；3)过阳离子交换柱，用pH5.5-6.5、含有0.1-0.5mol/L尿素的缓冲液进行第一次洗脱，然后用pH5.5-6.5、含有质量分数0.1％-1.0％的甜菜碱类表面活性剂的缓冲液进行第二次洗脱，收集洗脱组分。在一些实施方式中，所述的甜菜碱类表面活性剂选自十二烷基二羟乙基甜菜碱、十八烷基二羟乙基甜菜碱或椰油酰胺丙基甜菜碱。在一些实施方式中，步骤1)所述的分离为将发酵液进行4000-8000g离心，然后对上清液进行6000-8000g离心。在本专利技术实施例中，所述离心在SIGMA6K15离心机上进行，离心时间以10-15min为宜。离心的作用是分离细胞和发酵液以及去除细胞碎片。在一些实施方式中，步骤2)所述的调节pH是用柠檬酸溶液调节至电导7.0±0.20ms/cm。在一些实施方式中，步骤2)所述的调节pH前，将发酵液用0.45μm滤膜进行过滤，取上清液。在一些实施方式中，步骤3)中阳离子交换色谱的填料为Tosoh公司的ToyopearlCM650M，载样量≤60g蛋白质/L填料。可以用20mmol/LPBS，10mmol/L氯化钠，pH6.0平衡填料，满载好抗体后，用平衡缓冲溶液进行冲洗。在一些实施方式中，采用分段收集，从280nm紫外吸收值上升到总高度的1％开始收集，直到上升到最高值的80％为第一段；接着收集，直到吸收值降低到最高峰的10％为第二段，其中第二段收集物为阳离子纯化物。根据上述技术方案提供的方法，在一些实施方式中，步骤3)所述的第一次洗脱的洗脱液为pH6.0的含0.2mol/L尿素的20mmol/LPBS缓冲液，在一些更优的实施方式中，所述缓冲液为20mmol/LPBS缓冲液。在一些实施方式中，步骤3)所述的第二次洗脱的洗脱液为pH5.5-6.5、20-60mmol/L柠檬酸盐缓冲液，其中可以含有150-200mmol/L氯化钠。在一些更优的实施方式中，步骤3)所述的第二次洗脱的洗脱液为pH6.0、45mmol/L柠檬酸盐缓冲液；其中可以含有180mmol/L氯化钠、1％质量份的甜菜碱类表面活性剂和2％体积份的乙醇。上述柠檬酸盐缓冲液也可以是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、醋酸钠-醋酸缓冲液，或磷酸氢二钠-磷酸二氢本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗TNFα类单克隆抗体的阳离子交换色谱纯化方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其特征在于，上样平衡后，进行两次洗脱，其中第一次洗脱的洗脱液中含有0.1‑0.5mol/L尿素，第二次洗脱的洗脱液中含有质量分数0.1％‑1.0％的甜菜碱类表面活性剂。

【技术特征摘要】
2015.03.23 CN 20151012756311.抗TNFα类单克隆抗体的阳离子交换色谱纯化方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其特征
在于，上样平衡后，进行两次洗脱，其中第一次洗脱的洗脱液中含有0.1-0.5mol/L尿素，第二次洗脱的洗
脱液中含有质量分数0.1％-1.0％的甜菜碱类表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甜菜碱类表面活性剂选自十二烷基二羟乙基甜菜
碱、十八烷基二羟乙基甜菜碱或椰油酰胺丙基甜菜碱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一次洗脱的洗脱液为pH6.0的含0.2mol/L尿
素的20mmol/LPBS缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二次洗脱的洗脱液为pH5.5-6.5、含有质量分数
0.1％-1.0％的甜菜碱类表面活性剂和150-200mmol/L氯化钠的20-60mmol/L柠檬酸盐缓冲液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的柠檬酸盐缓冲液选自柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、
磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、醋酸钠-醋酸缓冲液，或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将CHO细胞发酵表达后菌液分离；
2)将发酵液用水稀释，调节pH至6.00±0.10；
3)过阳离子交换柱，用含有0.1-0.5mol/L尿素的缓冲液进行第一次洗脱；用含有质量分数0.1％-1.0％
的甜菜碱类表面活性剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪艳，杨彬，马旭通，林小鹊，李文佳，孙文正，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44