一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，该检测方法包括重组酶介导等温核酸扩增体系、反应缓冲液和结核分枝杆菌检测通用引物。该方法在等温条件下(35-45℃)进行，10-20分钟内，即可实现对结核分枝杆菌DNA的扩增。本发明专利技术所提供的检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速，便于现场及临床上的应用，该方法适用于对结核分枝杆菌的快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学检测领域，具体涉及一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法。
技术介绍
结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，M.tb）感染引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病，也是由单一致病菌引起死亡数最多的疾病，能够感染人和多种哺乳动物及禽类，其中导致人类感染的结核菌大多数是人型结核分枝杆菌。人体各个器官都可被其侵犯，但以肺结核为多见。其病理特征是在多种组织器官中形成肉芽肿和干酪样、钙化结节病变。该病是伴随人类历史最长的疾病之一，早在古希腊、古埃及时期就有结核病的记载。德国细菌学家柯赫于1882年发现并证实了结核分枝杆菌是导致结核病的病原菌。目前，全球结核病每年新发病例800万左右，其中80%集中在发展中国家。我国结核病疫情的主要特点是感染率高、耐药率高、患病率高等。结核病已成为全球重大公共卫生问题和社会问题。结核分枝杆菌简称结核杆菌，属于分枝杆菌属（Mycobacterium）。其基因组由共价闭合环状DNA组成。结核分枝杆菌为细长、直或微弯的杆菌，单在、少数成丛，大小为0.2-0.5μm×1.5-4.0μm。菌体两端有浓染颗粒，无鞭毛，无芽孢，无荚膜。该菌为专性厌氧菌，对营养要求严格。最适pH6.4-7.0，最适温度为37-37.5oC。生长缓慢，繁殖一代需18-24小时。对干燥、冷、酸等理化因素抵抗力较强，但对酒精及紫外线抵抗力较弱。具有一定的变异性，可发生菌落、形态、毒力及耐药性等变异，同时对异烟肼、利福平等药物极易产生耐药性。结核分枝杆菌包括人型、牛型、非洲型和鼠型，其中致人发病的主要是人型。结核分枝杆菌的致病性不依赖内毒素、外毒素及侵袭酶类，而主要与代谢产物的毒性、菌体成分及机体产生的免疫病理损伤密切相关。近年来，由于一些客观因素及人为因素的出现，如人免疫缺陷病（HIV）感染的流行、艾滋病毒的传播、人口增长以及多重耐药性结合分枝菌株的出现等，导致结核病的疫情在不断上升。因此，建立快速检测结核分枝杆菌的方法是必要的。传统的结核分枝杆菌检测方法由于检测周期长、漏检率高、程序复杂等缺点，已经远远不能满足临床检测的需求。分子生物学方法如核酸探针技术、基因芯片技术、聚合酶链式反应（PCR）以及等温核酸技术中的LAMP法已经建立起来，并且在结核分枝杆菌的检测上已得到较好的应用，大大缩短了检测的时间。应用探针技术可以在短期内处理大量样品，但由于其敏感性尚不够高、加之常常需要放射性标记，操作比较繁琐费时，因而限制了其应用。PCR技术如实时定量PCR、多重PCR以其高度的特异性及敏感性在结核分枝杆菌检测方面取得了重大的突破。但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。环介导等温核酸扩增技术克服了PCR技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点，已应用于沙门氏菌的检测。但是，LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高。由于现存结核分枝杆菌检测方法的不足以及结核分枝杆菌快速实地检测的需求，因此研究一种能在基层应用，可简单快速检测结核分枝杆菌的扩增方法非常有必要。本专利技术中的等温核酸扩增技术不仅检测时间短、灵敏度高，并且摆脱了昂贵仪器的束缚，可以在非实验室环境下进行，达到现场检测的目的。此外，该方法操作方便，对人员要求不高。因此该方法具有很高的推广应用价值，不仅适合于科研工作，还可以作为设备条件相对较差的基层单位相关人员进行常规和应急检测的工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用重组酶介导的等温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法，该检测方法的主要步骤是先进行结核分枝杆菌基因组的提取，将结核分枝杆菌基因组DNA加入到含有特异引物和探针的等温核酸扩增体系中进行扩增，在等温条件(35-45oC)下，10-20分钟即可检测扩增产物。本专利技术的具体技术方案如下：1．获取结核分枝杆菌DNA，设计结核分枝杆菌的引物和探针，建立结核分枝杆菌等温核酸扩增体系，将结核分枝杆菌DNA加入到扩增体系中，再加入反应缓冲液，在等温条件(35-45℃)下，10-20分钟即可检测到扩增产物。2．根据上述1所述的方法，建立结核分枝杆菌等温核酸扩增体系，如下所示：3．根据上述1、2所述的等温核酸扩增体系，将配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉末状，方便保存和运输。4．根据上述1所述的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，其中所述的反应缓冲液为终浓度为6%(w/v)的，分子量为35000的聚乙二醇水溶液。5．根据上述1、2所述的引物组，其引物序列为：正向引物序列：5’-TGACAAAGGCCACGTAGGCGAACCCTGCCCAG-3’,反向引物序列：5’-CAAAGCCCGCAGGACCACGATCGCTGATCCG-3’。6．根据上述1、2所述的等温核酸扩增体系，其探针序列为：5’-CACAGCCGGTTAGGTGCTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGACGAGATC-3。7．根据上述1、2所述的荧光等温核酸扩增方法，其特征在于，所使用的荧光探针为荧光/猝灭基团修饰的探针，所使用的荧光基团为FAM荧光基团。8．根据上述1所述的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，其扩增的最佳等温条件为39℃。9.根据上述1所述的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于，扩增的最佳时间为20分钟。10．根据上述1-9所述的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，其中将结核分枝杆菌DNA加入到等温核酸扩增体系中，体系体积可以是25μL、50μL、100μL中的任何一个体积或其它体积，最佳体积为50μL，反应体系加入结核分枝杆菌DNA，放入可检测FAM荧光的仪器中，39℃反应15分钟，即可观察到结核分枝杆菌DNA的扩增情况。本专利技术所提供的方法，更适合应用于有大量样品的检测，操作更为简单，对操作人员的技术要求更低。检测时间短，并且可同时检测大批量的样本，具有良好的特异性、敏感性和稳定性，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益附图说明图1为使用本专利技术的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的实时荧光结果图。具体实施方式下面用实施例来进一步详述本专利技术，但本专利技术的内容并不局限于此实施例一：1、样品来源及结核分枝杆菌DNA提取样本来源：杭州市疾病预防控制中心收集的，从不同患者痰液标本中分离培养并灭活而得的菌株核酸，菌株均已鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，该检测方法包括等温核酸扩增体系，引物组、探针和反应缓冲液，扩增在等温条件35‑45℃下进行，10‑20分钟内即可检测出结核分枝杆菌核酸。

【技术特征摘要】
1.一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，该检测方法包括等温核
酸扩增体系，引物组、探针和反应缓冲液，扩增在等温条件35-45℃下进行，10-20分钟内即
可检测出结核分枝杆菌核酸。
2.根据专利要求1所述的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，其特
征在于，所述等温核酸扩增体系及各组分含量为以下所示：
。
3.根据专利要求1、2所述的等温核酸扩增体系，其特征在于，所述的体系状态为冷冻干
燥后的粉末状。
4.根据专利要求1所述的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，其特
征在于，所述的反应缓冲液为终浓度为6%(w/v)的，分子量为35000的聚乙二醇水溶液。
5.根据专利要求1、2所述的引物组，其特征在于，所述引物序列为：
正向引物序列：5’-TGACAAAGGCCACGTAGGCGAACCCTGCCCAG-3’,
反向引物序列：5’-CAAAGCCCGCAGGACCACGATCGCTGATCCG-3’。
6.根据专利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈淑丹，刘伟，何蕾，鲍泽英，郭利川，刘小曼，汤赛君，王智宏，王秀东，应清界，
申请(专利权)人：江苏奇天基因生物科技有限公司，浙江国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32