本发明专利技术公开了一种用于检测口蹄疫病毒A型的引物、试剂盒、使用方法及其应用，所述的引物为引物对FMDA，其中，上游引物FMDAF：5′‑ACACCCTGAGGGATATT‑3′，下游引物FMDAR：5′‑CATACCGTACAAATGGG‑3′。本发明专利技术试剂盒的使用方法包括患病动物新鲜样品的采集，核酸提取；反转录聚合酶链反应，琼脂糖凝胶电泳检测。该方法特异性强、灵敏度高、操作简便、省工省时，提高了检测的准确性和特异性。本发明专利技术能快速、方便的检测口蹄疫A型毒株，可用于口蹄疫病毒流行病学调查与分析，具有广阔的市场应用前景和较大的经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于检测口蹄疫病毒A型的引物、试剂盒、使用方法及其应用，属于生物
技术介绍
口蹄疫(aphthaeepizooticae；footandmouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种人兽共患的急性、热性、高度接触性传染病，其临诊特征是在口腔粘膜、四肢下端及乳等处皮肤形成水疱和烂斑。该病传播迅速，流行面广，成年动物多取良性经过，幼龄动物多因心肌受损而死亡率较高。口蹄疫广泛流行于世界各地，造成了巨大的经济损失，各国政府及国际组织高度重视，被列为全球各国共同商定扑灭的头号法定传染病。随着国际贸易的日趋增加，物质交流和国际交往越来越频繁，给口蹄疫的预防和控制增加了难度，因此世界各国都花费大量人力、物力和财力来研究、控制和消灭口蹄疫。口蹄疫病毒(Foot-and-Mouthdiseasevirus)属于微RNA病毒科中的口蹄疫病毒属，是RNA病毒中最小的一个。口蹄疫病毒具有多型性、易变异的特点。根据其血清学特性，可以分为7个血清型，即A、O、C、SAT1(南非I)、SAT2(南非II型)、SAT3(南非III型)及Asia1型(亚洲1型)。各个血清型间无交叉免疫现象。每一个血清型又包含若干个亚型，同型各个亚型之间也仅有部分交叉免疫性。该病毒的这种特性给口蹄疫的防制带来了许多困难。口蹄疫病毒在患病动物的水疱液、水疱皮、淋巴液及发热期血液内的含量最高，其次是各组织器官、分泌物、排泄物，可长期存在并向外排毒，退热后病毒可以出现于乳、粪、尿、泪、涎水及各脏器中。口蹄疫病毒对外界环境的抵抗力很强，耐干燥。在自然条件下，含毒组织及污染的饲料、饮水、饲草、皮毛及土壤等所含病毒在数日乃至数周内仍具有感染性。口蹄疫病毒对酸和碱都特别敏感，在pH3.0和pH9.0以上的缓冲液中，病毒感染性将瞬间消失，2％～4％氢氧化钠、3％～5％福尔马林溶液、5％氨水、0.2％～0.5％过氧乙酸或5％次氯酸钠等均为口蹄疫病毒良好的消毒剂。口蹄疫是一种传染性极强的传染病，一经发生往往呈流行性，在牧区，多呈现大流行，疫情一旦发生，可随动物的流动迅速蔓延，经过一定时期后疫情才逐渐平息。口蹄疫可感染多种动物，偶蹄目动物易感性最高，易感性高低的顺序依次为黄牛、奶牛、牦牛、水牛、猪、羊、骆驼。对于口蹄疫的防治目前尚无特效药物疗法，主要采取综合防制措施及对症疗法。最根本的办法是消除患病动物、带毒动物和彻底消毒，切断传播途径。因此应加强检疫和口蹄疫监测，以防口蹄疫扩散。目前，根据流行病学、临诊症状和病例剖检特点可以做出口蹄疫的初步诊断，但确诊需要进行实验室诊断。病毒的分离与鉴定和血清学诊断是实验室诊断常用的方法，但较费时费力，耗时较长。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于检测口蹄疫病毒A型的引物、试剂盒、使用方法及其应用，采用本专利技术的试剂盒，能够在三个小时内做出诊断，为口蹄疫临床诊断和分子流行病学调查提供一种有效的分子生物学诊断方法。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种用于检测口蹄疫病毒A型的引物，所述的引物为引物对FMDA，其中，上游引物FMDAF：5′-ACACCCTGAGGGATATT-3′下游引物FMDAR：5′-CATACCGTACAAATGGG-3′。一种用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，所述的试剂盒包括引物对FMDA，其中，上游引物FMDAF：5′-ACACCCTGAGGGATATT-3′下游引物FMDAR：5′-CATACCGTACAAATGGG-3′。所述的试剂盒还包括5×RTBuffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制剂、反转录酶、超纯水、裂解液和冲洗液。所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。所述的裂解液的组分为：羟基喹啉3～5％(质量分数)、磷酸三氯乙酯3.2～5.2μM、异硫氰酸苯酯1.5～3.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮1.3～3.5％(质量分数)、氯化钠0.3～0.5M和柠檬酸钠0.6～0.9M。所述的冲洗液的组分为：三羟甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇60～80％(体积分数)；pH7.0。一种用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)样品的采集(2)样品RNA的提取(3)RT-PCR对样品RNA进行RT-PCR扩增，反应体系25μl：5×RTBuffer5μl、12.5μMdNTPs5μl、125μM上游引物FMDAF和125μM下游引物FMDAR各2μl、25U/μlTaq酶0.5μl、2.5U/μlRNA酶抑制剂1μl、2.5μM反转录酶1μl、超纯水3.5μl和5ng/μlRNA5μl；RT-PCR扩增程序为：50℃30min，94℃2min；94℃35s，55℃45s，72℃35s，共30个循环；72℃2min；(4)RT-PCR扩增产物的检测将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果。所述的样品的采集分为固体状动物组织的采集或液体状动物组织的采集；其中，固体状动物组织的采集方法为：无菌采集动物组织病料0.1-100mg，装入无RNA酶污染的离心管中备用；液体状动物组织的采集分为分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方法为：用鼻咽拭子采集鼻咽液，装入无RNA酶污染的离心管中备用；血液的采集方法为：取全血、血清或血浆10-100μl，加入无RNA酶污染的离心管中备用。所述的样品RNA的提取，具体方法为：(1)将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提取；(2)在研磨后成糊状的动物组织20-100mg或液体状动物组织20-100μl中，加裂解液500μl，12000rpm离心30s，分离出上清液；(3)将上清液转入离心管中，加无水乙醇500μl，分次转到RNA纯化柱上，12000rpm离心30s，得到粗提的RNA；(4)用冲洗液500μl冲洗RNA纯化柱，12000rpm离心30s；(5)将RNA纯化柱转到另一离心管，加超纯水50μl，12000rpm离心30s，得到病毒及组织基因组的RNA，于-20℃保存备用。一种用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒在检测口蹄疫病毒A型方面的应用。本专利技术的有益效果1、本专利技术对核酸提取过程进行改进，即采用与现有试剂盒不同配方的裂解液和冲洗液，大大缩短了核酸提取时间，使核酸的提取时间由原来的1-2小时缩短为2分钟，节省了核酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测口蹄疫病毒A型的引物，其特征在于，所述的引物为引物对FMDA，其中，上游引物FMDAF：5′‑ACACCCTGAGGGATATT‑3′下游引物FMDAR：5′‑CATACCGTACAAATGGG‑3′。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测口蹄疫病毒A型的引物，其特征在于，所述的引物为引物
对FMDA，其中，
上游引物FMDAF：5′-ACACCCTGAGGGATATT-3′
下游引物FMDAR：5′-CATACCGTACAAATGGG-3′。
2.一种用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包
括引物对FMDA，其中，
上游引物FMDAF：5′-ACACCCTGAGGGATATT-3′
下游引物FMDAR：5′-CATACCGTACAAATGGG-3′。
3.根据权利要求2所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，其特征在于，
所述的试剂盒还包括5×RTBuffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制剂、反转录酶、
超纯水、裂解液和冲洗液。
4.根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，其特征在于，
所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，其特征在于，
所述的裂解液的组分为：羟基喹啉3～5％(质量分数)、磷酸三氯乙酯3.2～5.2μM、
异硫氰酸苯酯1.5～3.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮1.3～3.5％(质量分数)、氯化钠
0.3～0.5M和柠檬酸钠0.6～0.9M。
6.根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，其特征在于，
所述的冲洗液的组分为：三羟甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇
60～80％(体积分数)；pH7.0。
7.一种如权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒的使用方法，
其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品的采集
(2)样品RNA的提取
(3)RT-PCR
对样品RNA进行RT-PCR扩增，反应体系25μl：5×RTBuffer5μl、12.5μM
dNTPs5μl、125μM上游引物FMDAF和125μM下游引物FMDAR各2μl、25U/μl
Taq酶0.5μl、2.5...
【专利技术属性】
技术研发人员：李海利，郎利敏，徐引弟，张青娴，游一，兰亚莉，蔺萍，侯自花，徐照学，冯亚杰，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41
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