含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液。据此，发明专利技术人还建立的相应的培养方法。试验表明，将O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐应用于水牛卵母细胞体外成熟，相比没有添加O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵子体外成熟液，可以显著提高水牛体外成熟卵子体外成熟质量及后续胚胎的发育能力，且O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐成本低，便于在水牛胚胎体外生产中推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于卵母细胞体外培养
，尤其涉及一种含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液及培养方法。
技术介绍
随着胚胎生物技术的发展，相对体内来源的卵子，利用离体的卵巢获得未成熟的卵子，经过体外成熟培养，可获得大量的成熟卵子，进行后续体外受精、体细胞克隆、胚胎干细胞等的研究及生产应用。而当前水牛卵母细胞体外成熟效率较低，限制了水牛胚胎生物工程的研究与应用。卵子成熟及后续胚胎发育到最终胚胎附植成功，这一过程需要很高的能量。体外培养液中添加碳水化合物对卵子完全成熟及胚胎发育起到很关键的作用，但最近的研究表明在卵子成熟及后续胚胎发育中脂肪酸的β-氧化是另外一种非常重要的能量来源。在供能特点上，脂肪酸代谢所产生的ATP是碳水化合物的几倍，且卵子及胚胎对碳水化合物所产生的ATP利用有限。虽然各种动物的卵子脂肪含量不尽相同，但研究表明，即使在小鼠卵子体外成熟中，通过添加脂肪代谢的抑制剂，可抑制小鼠卵子成熟及后续胚胎发育，结果提示脂肪代谢在卵母细胞及后续胚胎发育能力上起到至关重要的作用。脂肪酸主要成分为甘油三酯，以滴状被脂肪滴围绕的形式存在于细胞质中，经脂肪酶分解成不同长度及不同饱和度的脂肪酸，然后脂肪酸进入线粒体，进行β-氧化。L-肉碱线粒体膜上唯一的活化的脂肪酸载体，其主要功能是携带、转运活化的脂肪酸，进入线粒体内进行β-氧化和三羧酸循环反应，为机体的各种代谢活动提供能量。在小鼠及猪的腔前卵泡中添加L-肉碱可提高卵子的后续发育能力，但也有研究报道，在卵子成熟中添加L-肉碱，提高了胚胎的分裂率，但对后续囊胚的形成没有显著的影响。乙酰基的L-肉碱为L-肉碱的衍生物，当在需要的情况下，乙酰基L-肉碱可以很自然的转化为L-肉碱。有报道表明乙酰基L-肉碱比L-肉碱更具有抗氧化的能力，因此乙酰基L-肉碱比L-肉碱可能有更有效的生物药效率。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液及培养方法，以提高水牛体外成熟卵子后续的发育能力及胚胎质量。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液。O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的浓度为2.5-5.0mM。该水牛卵母细胞体外成熟液的组成为：溶质O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐为2.5mM，溶剂为含NaHCO326.2mM，Hepes5mM，10％ECS，3％BFF，0.5μg/mlFSH，5μg/mlLH，10μg/mlCysteine的TCM-199培养液。使用上述含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液进行水牛卵母细胞体外成熟的培养方法。上述培养方法，按以下操作进行：挑选出具有完整卵丘细胞包被的卵母细胞，先用洗卵液洗涤2次，再用成熟液洗涤2次，然后放入含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液中，于38.5℃、5％的CO2的环境内进行卵子体外成熟培养22-24h。针对目前水牛卵子体外成熟效率低的问题，专利技术人研制了一种含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液。据此，专利技术人还建立的相应的培养方法。试验表明，将O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐应用于水牛卵母细胞体外成熟，相比没有添加O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵子体外成熟液，可以显著提高水牛体外成熟卵子体外成熟质量及后续胚胎的发育能力，且O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐成本低，便于在水牛胚胎体外生产中推广应用。到目前为止，O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐能否用于水牛胚胎并提高水牛卵母细胞体外成熟质量还未见报道。专利技术人系结合O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的特点和功能，经深入研究而得本专利技术。其中，左旋肉碱的主要生理功能是：①转运脂肪酸进入线粒体并在此进行B-氧化，以促进脂肪燃烧提供能量，所以具有降血脂、提高人体运动能力和减肥等作用。②保护细胞：将过量的脂酰辅酶A排除体外防止其损坏细胞。③防止乳酸积累。激烈运动后产生大量乳酸，左旋肉碱可减少乳酸生成量，提高运动耐力。同时，它还有促进碳水化合物等物质能量利用，提高精子数目和活力等作用。除了具有与左旋肉碱相同的功能以外，乙酰左旋肉碱还具有如下功能：神经保护与神经促进功能，提高免疫功能。具体实施方式实施例1制备含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液：先制备50mMO-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的储存溶液，用200μl的EP管分装，每个110μl(用不含10％ECS，3％BFF，0.5μg/mlFSH，5μg/mlLH，10μg/mlCysteine这几个生长因子但含有NaHCO326.2mM，Hepes5mM的TCM-199溶液稀释)，用时稀释20倍，即取50μl的储存液体加入到950μl的水牛卵母细胞体外成熟工作液中。具体体外成熟液配方如下表1含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液的配方培养方法：用带有12号针头的10ml注射器从离体水牛卵巢抽取2-6mm的卵泡，在普通的体式显微镜下挑选出具有完整卵丘细胞包被的卵母细胞，先用洗卵液洗涤2次，再用成熟液洗涤2次；将水牛卵母细胞体外成熟培养液放在25mm×10mm的玻璃培养皿中，放入1ml成熟液，无盖矿物油，放卵子70-80个，于38.5℃、5％的CO2的环境内进行卵子体外成熟培养22-24h。按照前述培养方法得到水牛体外成熟的卵母细胞，挑选细胞质均匀、排出第一机体的卵母细胞进行卵子后续发育潜能的评估。在5μm的Ionomycin中处理5min，再在2.5mM的6-DMAP中作用4h，放入含有水牛颗粒细胞单层共培养体系中进行培养，20μl每滴，每滴放入15-20h胚胎进行培养，每48h半量换液，孤雌激活后第2d观察胚胎分裂率，第7d观察囊胚形成率。结果显示，在水牛卵母细胞体外成熟液中添加2.5mMO-乙酰基-L-肉碱盐酸盐，经化学激活后，第2d的分裂率79.31％显著高于不添加组64.38％，比对照组提高14.93％。第7d的囊胚形成率为26.45％，显著高于对照组13.70％，比对照组提高12.75％(参见表2)表2组别胚胎数分裂数(％)囊胚数(％)07347(64.38)b10(13.70)b2.5mM8769(79.31)a23(26.45)a5mM6842(61.76)b7(10.29)b注：同列数字不同字母表示差异显著(P＜0.05)。结果证实，添加2.5mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
含O‑乙酰基‑L‑肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液。

【技术特征摘要】
1.含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液。
2.根据权利要求1所述的含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液，其特征
在于：所述O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的浓度为2.5-5.0mM。
3.根据权利要求2所述的含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐的水牛卵母细胞体外成熟液，其特征
在于该水牛卵母细胞体外成熟液的组成为：溶质O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐为2.5mM，
溶剂为含NaHCO326.2mM，Hepes5mM，10％ECS，3％BFF，0.5μg/mlFSH，5μg/mlLH...

【专利技术属性】
技术研发人员：许惠艳，卢克焕，陆阳清，卢晟盛，杨小淦，谢龙，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45