本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，本发明专利技术属于动物病毒学和分子生物学技术领域。该试剂盒包括SEQ ID1~4所示的引物序列，还包括了RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶等组分。本发明专利技术建立的试剂盒对猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株一步法三重RT-PCR的检测方法，该多重RT-PCR检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高、操作简单，为猪流行性腹泻的流行病学及病原的鉴别诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物病毒学和分子生物学
，涉及一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，具体为针对变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株一步法三重RT-PCR的检测方法及应用。
技术介绍
猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，该病的主要特征是急性水样腹泻、呕吐和脱水死亡；各种年龄阶段的猪只均易感，对1～2周龄哺乳仔猪危害最为严重，发病死亡率可高达90%～100%，给养猪业造成了严重的危害和经济损失。20世纪70年代，英国和比利时各自率先报道了该病的发生，随后该病在世界上多个主要养猪国家相继暴发和流行，近年来亚洲一些国家如泰国、韩国、越南和中国多次报道了PED。PEDV是套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒亚科（Coronavirinae）甲型冠状病毒属（Alphacoronavirus）的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV基因组全长约28Kb，包括5’端非编码区、3’端非编码区以及至少７个开放阅读框（ORF1a,ORF1b,ORF2~6），分别编码主要结构蛋白：纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）、小包膜蛋白（E）和非结构蛋白（复制酶1a、1b、ORF3蛋白）。S蛋白为Ⅰ型跨膜蛋白，位于病毒粒子的表面，它在诱导感染宿主中和抗体的产生、与特异性受体的结合及细胞膜融合方面发挥着十分重要的作用。此外，冠状病毒S基因的变异可以引起病毒组织嗜性的改变和病毒毒力的变化。ORF3基因是PEDV的一个附属基因，编码一种离子通道蛋白，可调节病毒产量，可能病毒的毒力有关。PEDV弱毒疫苗株的ORF3基因在245-294bp存在49或51个核苷酸的缺失，是弱毒株重要的分子标记。2010年底开始，PED在我国大范围暴发流行，临床上主要表现为高发病率和高死亡率的哺乳仔猪腹泻（病死率达80%～100%），造成了大量的哺乳仔猪死亡。当前，我国流行PEDV毒株主要存在两种类型，即PEDV经典毒株和PEDV变异毒株，并且以变异毒株为优势流行毒株。PEDV基因组中变异最大的区域位于S基因，且大多数的变异都聚集在S基因的N端。与早期流行的经典毒株（PEDVCV777）相比，PEDV变异毒株的S基因在N端存在15个碱基的插入和6个碱基的缺失，从而导致流行毒株Ｓ蛋白的抗原位点、糖基化位点和跨膜螺旋均有明显变化。此外，研究显示在采集的临床样品中还存在与弱毒疫苗株高度同源的毒株。当前我国广泛流行的PEDV以变异毒株为优势毒株、经典毒株并存为特点，再加上弱毒株的广泛使用，使得临床上的PEDV毒株错综复杂。常规检测病毒分离、免疫组化、免疫荧光试验及常规RT-PCR等并不能区分PEDV毒株类型；基因测序是鉴定毒株类型的有效方式，但该方法操作复杂、消耗时间长、费用成本高。我国目前尚无鉴别诊断猪流行性腹泻病毒变异株、经典毒株和弱毒疫苗株的多重RT-PCR方法。因此，有必要建立一种快速简便有效的猪流行性腹泻病毒变异株、经典毒株和弱毒疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法。基于以上的研究和当前的需求，本研究根据PEDV弱毒疫苗株ORF3基因缺失49个核苷酸以及变异毒株S基因连续的核苷酸插入的特征，设计并合成了2对检测猪流行性腹泻病毒的引物，采用多重RT-PCR方法扩增ORF3基因和S基因片段，通过扩增片段的数量和分子量大小，判断是猪流行性腹泻病毒变异株、经典毒株还是猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株，从而特异、敏感、快速简便、低成本、有效的鉴别诊断猪流行性腹泻病毒的毒株类型。
技术实现思路
本专利技术的目的为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法，降低成本，并能快速、有效的检测出猪流行性腹泻病毒的三种毒株，提供一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括以下引物序列：ORF3-F5’-gcgcgttttgctgtcat-3’（SEQID1），ORF3-R5’-gtcaccaccttctaaaatcac-3’（SEQID2）；S-P15’-gaaaaccagggtgtcaat-3’（SEQID3），S-P25’-cagcaagaatgacagaggtg-3’（SEQID4）。优选地，所述的引物ORF3-F、ORF3-R扩增PEDV的ORF3基因片段。优选地，所述试剂盒包括以下组分：RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。优选地，所述的RT-PCR反应缓冲液包括RNA模板14μL，5×PrimeScriptTM缓冲液4μL，RTEnzymeMix1.0μL，反转录引物Oligo18T1.0μL。优选地，所述的RT-PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性40s，52℃复性40s，72℃延伸50s，40个循环；最后72℃延伸8min。优选地，一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的应用。优选地，所述的引物ORF3-F、ORF3-R扩增变异毒株和经典毒株预期目的片段大小为234bp，弱毒疫苗株预期目的片段大小为185bp。本专利技术的有益效果为：根据GenBank中公布的PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因，设计合成2对特异性扩增引物，用以特异性的扩增PEDVS基因和ORF3基因，通过目的片段的数量和片段大小以判断PEDV的毒株类型；通过对退火温度等反应条件的优化，建立了检测不同PEDV毒株类型的多重RT-PCR检测试剂盒。本专利技术建立的多重RT-PCR检测试剂盒能特异性区分PEDV变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株；PEDV变异毒株扩增出2条目的条带，分别为234bp的ORF3基因片段和826bp的S基因片段；PEDV经典毒株扩增出1条目的条带，片段大小为234bp的ORF3基因片段；而弱毒疫苗株扩增出1条目的条带，片段大小为185bp的ORF3基因片段；与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒、猪细环病毒及猪细小病毒均无交叉反应；敏感性试验显示，该方法能检测到的最低核酸浓度为2.3×10-4ng/μL；且该方法具有良好的重复性。利用该方法对采集自广西部分地区的91份临床腹本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪流行性腹泻病毒的多重RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下引物序列：ORF3‑F 5’‑ gcg cgt ttt gct gtc at‑3’ （SEQ ID 1），ORF3‑R 5’‑ gtc acc acc ttc taa aat cac ‑3’ （SEQ ID 2）；S‑P1 5’‑gaa aac cag ggt gtc aat‑3’ （SEQ ID3），S‑P2 5’‑cag caa gaa tga cag agg tg‑3’ （SEQ ID 4）。
【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以
下引物序列：
ORF3-F5’-gcgcgttttgctgtcat-3’（SEQID1），
ORF3-R5’-gtcaccaccttctaaaatcac-3’（SEQID2）；
S-P15’-gaaaaccagggtgtcaat-3’（SEQID3），
S-P25’-cagcaagaatgacagaggtg-3’（SEQID4）。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所
述的引物ORF3-F、ORF3-R扩增PEDV的ORF3基因片段。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所
述试剂盒包括以下组分：RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。
4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦毅斌，卢冰霞，段群棚，何颖，李斌，梁家幸，苏乾莲，周英宁，蒋冬福，卢敬专，赵武，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
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